- Đối với mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng
3.4.6 Phương pháp xác định một số yếu tố gây bệnh (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các
(Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
* Tách DNA:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vô trùng. Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA để làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104 (definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả: Suzuki và cs, 1994[75]; Pritchett và cs, 2000[67]; Saitoh và cs, 2005[70]; Cloeckaert và cs, 2006[46]; Cortez và cs, 2006[47]; Skyberg và cs, 2006[73]. (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) Stn- F Stn- R 5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’ 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3’ 259 InvA- F InvA- R 5’- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3’ 5’- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3’ 521 104SR- F 104SR-R 5’- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3’ 5’- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3’ 162 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần:
- 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2, 200µM của mỗi loại dNTP].
- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
- Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50oC/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72oC/ 7 phút.
* Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
*Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vòng 15 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng DNA được so với DNA chuẩn (DNA marker).