- Đối với mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng
3.4.4 Phương pháp xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella phân lập được
Xác định serotyp của các chủng Salmonella phân lập được bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản) đối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu được, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001[66]).
3.4.4.1 Xác định nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Slide Aglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được sử dụng rất phổ biến trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán và giám định các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường để tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn đa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kính sạch làm 2 phần: 1 phần làm đối chứng, và 1 phần làm thí nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiếm kính một giọt nước sinh lý.
TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên.
+ Nhỏ tiếp vào bên thí nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh đa giá nhóm O, còn bên đối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn đều, lắc nhẹ phiến kính trong khoảng 30 – 60 giây.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên đối chứng âm huyễn dịch vẫn đục đều.
3.4.4.2 Xác định kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O
Các chủng cho kết quả dương tính với kháng huyết thanh O đa giá, tiếp tục được xác định với các kháng huyết thanh đơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp đã được trình bày ở phần 3.4.4.1.
3.4.4.3 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi đã xác định kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục tiến hành xác định kháng nguyên H của chúng.
3.4.4.3.1 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Các chủng vi khuẩn Salmonella cần định typ được cấy trên môi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) để tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục đích là để cố định kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha đến H1 vào mỗi ống nghiệm. + Dùng Micropipet, hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây, các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều.
3.4.4.3.2 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác định kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tôi tiến hành xác định tiếp kháng nguyên H pha 2 của
chúng.
+ Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0.25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 đầu. + Để ống nghiệm đó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau đó nhỏ 50 µl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần định typ, cấy thẳng vào phía trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau đó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn đã phát triển trong môi trường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấy vào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, để nghiêng týp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ.
+ Thêm vào đó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước muối sinh lý + 1% Formalin), để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt độ 50oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây, các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều.