PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi tại một
số tỉnh phía Bắc và xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella ở các cơ quan phủ tạng của lợn bệnh.
3.1.2 Xác định một số đặc tính sinh vật hóa học, serotyp và xác định khả năng
mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được.
3.1.3 Xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được
bằng phản ứng PCR: khả năng sản sinh độc tố, khả năng xâm nhập và khả năng kháng kháng sinh
3.1.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được trên chuột bạch
và gây bệnh thực nghiệm trên lợn
3.1.5 Xác định hiệu lực phòng bệnh của vacxin được chế tạo từ vi khuẩn
Salmonella phân lập được trên động vật thí nghiệm.
3.2 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Lợn con sau cai sữa nuôi tại các trại chăn nuôi ở Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình.
- Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng Viện Thú y.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009
3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu
3.3.1 Mẫu thí nghiệm
Mẫu thí nghiệm là phân và phủ tạng (gan, lách, hạch màng treo ruột, chất chứa ruột và máu tim) của lợn (4-9 tuần tuổi) ốm và chết bị tiêu chảy có các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra được nuôi tại các trại chăn nuôi tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình.
3.3.2 Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 18-20 g/con - Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa được tiêm vacxin Phó thương hàn.
3.3.3 Các loại môi trường, hóa chất
* Các loại môi trường
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (của các hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm:
- Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM
Salmonella và thạch DHL dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
- Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng để giám định vi khuẩn Salmonella
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn
* Các loại hóa chất
- Các loại đường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroze, Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze
- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
3.3.4 Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella
Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định type kháng nguyên O và H của vi khuẩn
Salmonella
3.3.5 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR
- Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, đệm điện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm điện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide).
S. typhimurium, S. enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp lấy mẫu