Hoạt tính gây độc tế bào trên các dịng tế bào ung thư vú MCF–7 và ung thư cổ tử cung HeLa được thử nghiệm trên các hợp chất tinh khiết cơ lập được, với phương pháp Sulforhodamine B (SRB).[50]
2.2.2.1. Nguyên tắc
Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm, tích điện âm, sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đĩ SRB liên kết với protein tế bào được hịa tan tạo dung dịch trong suốt, cĩ màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương ứng với protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
2.2.2.2. Hĩa chất và dụng cụ
Dịng tế bào ung thư vú, MCF–7 và dịng tế bào ung thư cổ tử cung, HeLa [được cung cấp bởi Division of Cancer Treatment and Diagnosis Tumour Repository, NCI (Viện Ung thư Hoa Kỳ), Maryland, Mỹ];
Sulforhodamine B; Camptothecin (SIGMA); DMSO;
Trichloroacetic acid, acetic acid; Tris-base;
Máy đo độ hấp thu quang (ELISA MULTISKAN ASCENT); Đĩa 96 giếng;
Các dụng cụ thơng thường khác như: pippetman, ependorf, đầu tip, falcol.
2.2.2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB
Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB được trình bày trong Sơ đồ 2.5.
2.2.2.4. Thiết kế khảo sát
Một mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01 g/ml. Một mẫu chứng âm: tế bào với dung mơi hịa tan chất thử (DMSO 0,25%). Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc.
Thiết kế thử nghiệm của một mẫu bao gồm hai giếng tế bào cĩ mơi trường nuơi cấy chất thử ở nồng độ khảo sát và hai giếng khơng cĩ tế bào cĩ mơi trường nuơi cấy chất thử ở nồng độ khảo sát (hai giếng blank).
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.
2.2.2.5. Xử lý kết quả
Sau khi cĩ giá trị mật độ quang ở các bước sĩng 492 nm và 620 nm (ký hiệu OD492 và OD620), tính tốn các giá trị như sau:
Tính giá trị OD492 (hoặc OD620) = ODtb – ODblank (1) Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (2) Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo cơng thức
TN C OD %I (1 ) 100% OD Với:
ODtb : giá trị OD của giếng cĩ chứa tế bào ODblank : giá trị OD của giếng blank
ODTN : giá trị OD của mẫu thử tính từ cơng thức (1) và (2)
Sơ đồ2.5. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB[50]
2.2.2.6. Nơi thực hiện thử nghiệm
Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ mơn Di truyền, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
Giải đơng nguồn tế bào ung thư bảo quản trong nitrogen lỏng. Nuơi tế bào trong bình nuơi cấy đạt độ phủ khoảng 70-80%
Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào là 104 tế bào/giếng Ủ ở 37 oC, 5% CO2, 24 giờ
Bổ sung mơi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đơi nồng độ muốn thử (khơng loại bỏ mơi trường cũ đã cĩ ở trong giếng)
Ủ ở 37 oC, 5% CO2, 48 giờ
Cố định tế bào trong giếng với trichloroacetic acid 50%: Đặt đĩa trên vào tủ lạnh (4 oC), 1-3 giờ
Loại bỏ chất lỏng trong mỗi giếng
Rửa nhẹ nhàng với nước (200 l/giếng), 5 lần Để khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng, 12-24 giờ
Nhuộm SRB:
Cho dung dịch SRB 0,2% vào mỗi giếng Ủ ở nhiệt độ phịng, 5-20 phút
Loại bỏ dung dịch SRB
Rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch acetic acid 1% (5 lần) Để khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng, 12-24 giờ
Đọc kết quả:
Cho 200 ml Tris-base 10 mM vào mỗi giếng
Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hồn tồn Đo mật độ quang ở các bước sĩng 492 nm và 620 nm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN