Năm 1947, Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg đã tiến hành nuôi cấy Bacillus licheniformis và thu được loại enzyme Subtilisin
Carlsberg. Nó được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) và Alcalase là một dẫn xuất thuộc nhóm này đã được thương mại hóa. Điều kiện hoạt động tối ưu của Alcalase là ở khoảng pH hơi kiềm. Một số nghiên cứu cho thấy enzyme Alcalase hoạt động tối ưu ở pH = 7 – 8, nhiệt độ 50 – 600C (Liaset và cộng sự, 2002), DH tối đa 15 – 25%. Alcalase được xếp vào nhóm endoprotease, nó bị bất hoạt ở điều kiện pH thấp. Enzyme cho khả năng không hút nước của các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có
vị đắng (Adler-Nissen,1986) đồng thời sản phẩm có sự cân bằng về các amino acid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000).
CHƯƠNG II:
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm
Đối tượng nghiên cứu là đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) chế biến tại công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods F17 – Khánh Hòa
2.1.2 Enzyme Alcalase
Đề tài sử dụng enzyme Alcalase 2.4L FG được mua tại công ty Novozyme, TP.HCM.
Hoạt tính enzyme Alcalase 2,4 AU-A/g. Nhiệt độ bảo quản ở 40C.
pH = 7 – 8.
Nhiệt độ 50 – 600C . DH tối đa 15 – 25%.
2.1.3 Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết cho phân tích.
2.1.4 Thiết bị
Bể ổn nhiệt MEMMERT WNB 22 (L1), hãng sản xuất Memmert – Đức. Thiết bị đo quang phổ UV – VIS Varian Cary 100, hãng Varian – Úc. Tủ sấy MEMMERT SFE 500, hãng Memmert – Đức.
Lò nung điện LH15/13, hãng sản xuất Naberthern – Đức Cân phân tích PA 213/ PA 213 C, hãng sản xuất Ohaus – USA Bút đo pH Tester30, hãng sản xuất Eutech - USA
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) chế biến tại công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods F17 – Khánh Hòa. Yêu cầu nguyên liệu tôm còn tươi,
không có mùi lạ, không bị biến đỏ hoặc thối đen, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy, cho vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá nhiệt độ < 50C, vận chuyển về phòng thí nghiệm. Sau đó đầu tôm được xay nhuyễn bằng máy xay (kích thước mẫu sau khi xay là 0,3 – 0,8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Nguyên liệu khi chưa dùng ngay được cân cho vào túi nilon (mỗi túi ~ 1kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -600C tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Đầu tôm tươi
Xác định thành phần hóa học nguyên liệu ban đầu
Đánh giá hiệu quả xử lý nhiệt ban đầu và bổ sung enzyme Alcalase
Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein bằng Alcalase
Tối ưu quá trình khử protein bằng enzyme Alcalse
2.2.3 Xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Đầu tôm tươi
Xác định độ ẩm Xác định hàm lượng khoáng
Xác định hàm lượng protein
2.2.4 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme sung enzyme
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme
Mô tả thí nghiệm:
Nguyên liệu đầu tôm tươi sau khi xay nhỏ chia làm 2 lô:
Lô 1: Cân mỗi bình 100g đầu tôm đã xay Bổ sung nước với tỷ lệ 1/1 (v/w) Xử lý nhiệt ở 900C trong 15 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng và đo giá trị
Đầu tôm Xử lý nhiệt Không xử lý nhiệt Xay nhỏ Không bổ sung enzyme Bổ sung Alcalase (0,2%, 600C, 6h) Không bổ sung enzyme Bổ sung Alcalase (0,2%, 600C, 6h) Lọc, rửa Bã
Kiểm tra hàm lượng protein
pH. Bổ sung Alcalase nồng độ 0,2% trong 6 giờ ở 600C. Mẫu đối chứng thực hiện như trên nhưng không bổ sung enzme Alcalase.
Lô 2: Cân mỗi bình 100g đầu tôm đã xay Bổ sung nước với tỷ lệ 1/1 (v/w) Đo giá trị pH. Bổ sung enzyme Alcalase nồng độ 0,2% trong 6 giờ ở 600C. Mẫu đối chứng thực hiện như trên nhưng không bổ sung Alcalase.
Mẫu sau khi thủy phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 5 phút. Lọc rửa lấy bã, kiểm tra hiệu suất khử protein và hàm lượng protein còn lại trên bã. Từ kết quả thu được đánh giá hiệu quả khử protein giữa việc xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt trên nguyên liệu đầu tôm tươi và việc bổ sung enzyme Alcalase. Mỗi mẫu thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.2.5 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein bằng Alcalase protein bằng Alcalase
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả khử protein
Nhiệt độ: 50 – 700C Thời gian: 2 – 8h
Tỷ lệ E/S (v/w): 0,1 – 0,4% Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1
Kiểm tra hiệu suất khử protein
Dịch thủy phân Nguyên liệu đầu tôm
Xay nhỏ
Thủy phân bằng enzyme Alcalase
Mô tả quy trình:
Tùy thuộc vào kết quả thí nghiệm ở mục 2.2.3, nguyên liệu sẽ được xử lý nhiệt hoặc không để tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả khử protein bằng enzyme Alcalase trong điều kiện thí nghiệm nhiệt độ 50 – 700C, thời gian 2 – 8 giờ, tỷ lệ E/S từ 0,1 – 0,4%. Sau khi thủy phân, bất hoạt enzyme trong 5 phút ở 900C. Lọc rửa bã và kiểm tra hiệu suất khử protein.
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng mô hình 2 Lever Factorial với 3 biến nồng độ enzyme/nguyên liệu (X1), nhiệt độ thủy phân (X2) và thời gian thủy phân (X3) (Bảng 2.1) để thiết kế thí nghiệm. Ma trận thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.1 Thiết kế mức thực nghiệm của các tham số trong quy trình xác định ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein
Mức Tham số -1.0 1.0 X1: Tỷ lệ E/S (%) 0,1 0,4 X2: Nhiệt độ (0C) 50 70 X3: Thời gian (h) 2 8
Bảng 2.2 Ma trận thí nghiệm theo DX – 2 Lever Factor
STT Block Tỷ lệ E/S (%) Nhiệt độ (0C) Thời gian (h) Hiệu suất khử protein (%) 1 Ngày 1 0.1 50 2 87.03191 2 Ngày 1 0.4 50 2 89.066 3 Ngày 1 0.1 70 2 91.22136 4 Ngày 1 0.4 70 2 91.55057 5 Ngày 1 0.25 60 5 93.91991 6 Ngày 1 0.25 60 5 93.78408 7 Ngày 1 0.25 60 5 93.26112 8 Ngày 1 0.1 50 8 92.99179 9 Ngày 1 0.4 50 8 95.25166 10 Ngày 1 0.1 70 8 93.1934 11 Ngày 1 0.4 70 8 93.98702 12 Ngày 2 0.1 50 2 85.26511 13 Ngày 2 0.4 50 2 87.27329 14 Ngày 2 0.1 70 2 89.19905 15 Ngày 2 0.4 70 2 91.56077 16 Ngày 2 0.25 60 5 93.40258 17 Ngày 2 0.25 60 5 93.25963 18 Ngày 2 0.25 60 5 93.45645 19 Ngày 2 0.1 50 8 93.38078 20 Ngày 2 0.4 50 8 94.90575 21 Ngày 2 0.1 70 8 93.84317 22 Ngày 2 0.4 70 8 95.01663 23 Ngày 3 0.1 50 2 86.22694 24 Ngày 3 0.4 50 2 88.13662 25 Ngày 3 0.1 70 2 90.35177 26 Ngày 3 0.4 70 2 90.92669 27 Ngày 3 0.25 60 5 93.72848 28 Ngày 3 0.25 60 5 93.60801 29 Ngày 3 0.25 60 5 93.57045 30 Ngày 3 0.1 50 8 92.58238 31 Ngày 3 0.4 50 8 95.04263 32 Ngày 3 0.1 70 8 93.00983 33 Ngày 3 0.4 70 8 94.78199
2.2.6 Bố trí thí nghiệm tối ưu quy trình khử protein bằng Alcalase
Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase
Mô tả thí nghiệm
Đầu tôm, xay nhỏ, cân vào mỗi bình khoảng 100g, thêm 100ml nước cất. Bổ sung enzyme Alcalase với các mức điều kiện như trên. Sau khi thủy phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 5 phút. Lọc rửa bã. Bã này sau khi phơi khô đem xác định độ ẩm và kiểm tra hàm lượng protein còn lại trên bã, hiệu quả khử protein. Phân tích kết quả và chọn ra quy trình tối ưu phù hợp nhất với mục tiêu nghiên cứu.
Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng mô hình Box Behnken để thiết kế thí nghiệm tối ưu quy trình khử protein với 3 yếu tố thời gian thủy phân (X1), nhiệt độ (X2), tỷ lệ E/S (X3), và hàm mục tiêu (Y) là hiệu quả khử protein. Ma trận thí nghiệm bố trí như trong bảng 2.4.
Xay nhỏ
Thủy phân bằng Alcalase
Xác định hàm lượng protein còn lại trên bã Lọc rửa bã Nhiệt độ: 50 – 700C Thời gian: 2 – 8h Nồng độ enzyme: 0,1 – 0,4% Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1 Đầu tôm
Bảng 2.3 Mức thực nghiệm dự kiến của các tham số tối ưu Mức Tham số -1,0 0,0 1,0 X1: Thời gian (h) 2 5 8 X2: Nhiệt độ (0C) 50 60 70 X3: Tỷ lệ E/S 0,1 0,25 0,4
Bảng 2.4 Ma trận thí nghiệm dự kiến tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase theo mô hình Box – Behnken
Std X1: Thời gian (h) X2: Nhiệt độ (0C) X3: Nồng độ E/S (%) Y:
Hiệu quả khử protein (%)
1 3 50 0.25 2 7 50 0.25 3 3 70 0.25 4 7 70 0.25 5 3 60 0.1 6 7 60 0.1 7 3 60 0.4 8 7 60 0.4 9 5 50 0.1 10 5 70 0.1 11 5 50 0.4 12 5 70 0.4 13 5 60 0.25 14 5 60 0.25 15 5 60 0.25
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH.
- Xác định hàm lượng protein trong đầu tôm bằng phương pháp biuret (AACC, 2000).
- Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 6000C (AOAC, 1990).
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở 1050C tới khối lượng không đổi (AOAC, 1990).
- Hiệu suất khử protein:
(%)DP = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O) Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý. O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý.
- Hiệu suất khử khoáng:
(%)DA = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý.
2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu. Số liệu báo cáo là kết quả trung bình của 3 lần lặp đó.
Kết quả được phân tích và xử lý trên phần mềm Excel 2007 và phần mềm Design Expert 7.0 (Stat-Ease, Inc.) với ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%,
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Để đánh giá được chất lượng và hiệu suất thu hồi protein và chitin cần xác định thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng dùng làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
STT Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng
1 Độ ẩm (%) 78,32 ± 1,35
2 Hàm lượng Khoáng* (%) 20,70 ± 0,65 3 Hàm lượng Protein* (%) 49,80 ± 0,92 (*) Tính theo hàm lượng chất khô
Kết quả phân tích cho thấy phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng có độ ẩm rất cao tới 78,32%, tiếp đó là hàm lượng protein thô tới 49,80% theo trọng lượng khô, hàm lượng khoáng cũng tương đối cao tới 20,70%. Do đó, cần có phương pháp loại bỏ bớt thành phần protein trong nguyên liệu trước khi đưa vào sản xuất.
So sánh với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Trí và cộng sự (2009) thành phần khoáng của nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng trước khi ép là 20,8% thì không có sự khác biệt lớn. Kết quả này thấp hơn trong nghiên cứu của TS.Trang Sĩ Trung (2010) thì hàm lượng protein trên đầu là 50 – 53% theo trọng lượng khô và hàm lượng khoáng là 24,6%. Thành phần protein của loại tôm này cao hơn trong quy trình xử lý phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri 39,42% (Holanda and Netto,
2006). Sự khác biệt về kết quả giữa các nghiên cứu có thể là do phế liệu tôm ở những khu vực khác nhau có thành phần hóa học khác nhau hoặc cùng một loài nhưng tùy thuộc giai đoạn sinh trưởng, trạng thái dinh dưỡng, mùa vụ khác nhau mà thành phần hóa học khác nhau… Như vậy, đầu tôm thẻ chân trắng thích hợp cho việc nghiên cứu thu hồi, sản xuất protein và chitin, đồng thời nên có hướng tận thu dịch protein sau thủy phân góp phần giảm ô nhiễm môi trường, tăng hiệu quả kinh tế.
3.2 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme Alcalase được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung Alcalase đến hiệu quả khử protein. Chữ cái a, b, c, d khác nhau trên các
cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với p < 0,05.
Kết quả trên cho thấy việc không xử lý nhiệt nguyên liệu tươi ban đầu cho hiệu quả khử protein cao hơn so với việc xử lý nhiệt. Kết quả này có thể được giải thích do enzyme nội tại trong đầu tôm hoạt động rất mạnh. Cũng như tất cả các động vật thủy sản khác, protease nội bào tập trung chủ yếu ở cơ quan tiêu hóa, sau đến cơ quan nội tạng và cơ thịt. Đối với tôm, do cơ quan tiêu hóa và nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều ở đầu nhất. Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt tiêu hóa protein của giáp xác và nhất là tôm rất giống với enzyme nội tạng có trong dạ dày cá. Chúng tồn tại chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astaxin, collagenase…
Trong các nghiên cứu trước đây về hệ enzyme protease trong tôm cũng chỉ ra rằng enzyme protease ở tôm không những bao gồm nhiều loại khác nhau, mà còn có
CD1: không nhiệt - không enzyme CD2: không nhiệt - có enzyme CD3: có nhiệt - không enzyme CD4: có nhiệt - có enzyme
đặc tính của hệ thay đổi khi tách chiết từ các loài tôm khác nhau. Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 600C và 500C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5. Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá. Enzyme protease từ đầu tôm càng xanh có nhiệt độ thích hợp là 550C, pH tối thích là 8,0 (Nguyễn Văn Truyền, 2006). Hệ enzyme protease từ đầu tôm sú
Penaeus monodon, bền nhiệt, nhiệt độ tối thích là 620C, thuộc nhóm protease serine, trong đó có các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động (Nguyễn Lệ Hà, 2009).
Bên cạnh đó việc xử lý nhiệt nguyên liệu tươi ban đầu cũng ảnh hưởng tới giá trị pH. Kết quả theo dõi cho thấy giá trị pH của mẫu có xử lý nhiệt dao động ở 8,20 trong khi với mẫu không xử lý nhiệt thì giá trị pH là 7,78 (Bảng 1, Phụ lục 2).
Kết quả nghiên cứu giá trị pH và hiệu quả khử khi không xử lý nhiệt cao hơn khi có xử lý nhiệt lần lượt là 89,54% và 82,93%. Chứng tỏ pH của enzyme Alcalase và enzyme nội tại ở đầu tôm chủ yếu thuộc nhóm enzyme protease kiềm yếu.
pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng ion hóa của enzyme, cơ chất và độ nhớt của môi trường … từ đó ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme, vì vậy ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng thủy phân. Tại pH tối ưu thì enzyme hoạt động mạnh, tốc độ phản ứng tăng. Khi pH quá cao hay quá thấp đều gây biến tính protein và enzyme dẫn đến ức chế hoạt động xúc tác của enzyme, từ đó làm giảm tốc dộ phản ứng thủy phân.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng (1999), hệ protease trong đầu tôm hoạt động ở pH nghiêng về môi trường kiềm. Khi tăng pH lớn hơn 8,0 thì protein