Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thực nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm, đề suất quy trình ứng dụng enzyme Alcalase vào quá trình sản xuất chitin từ phế liệu đầu tôm như sau:
Hình 3.11 Quy trình đề suất khử protein đầu tôm bằng Alcalase
Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu được tiếp nhận theo phương pháp thu nhận mẫu, sau đó xay nhỏ kích thước 0,3 – 0,8cm, bổ sung nước theo tỷ lệ 1/1 (v/w), bổ sung enzyme nồng độ 0,2%. Đặt vào bể ổn nhiệt ở 600C, định kỳ khuấy đảo trong suốt quá trình thủy phân. Sau 6 giờ bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 5 phút. Lọc rửa thu bã và dịch thủy phân có thể dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng hiệu quả kinh tế.
Đầu tôm tươi
Xay nhỏ (0,3 – 0,8cm) Khử bằng Alcalase Bất hoạt enzyme (900C, 5 phút) Lọc rửa Bã Chitin thô Phơi khô Dịch thủy phân -Nhiệt độ 600C -Thời gian 6 giờ -Tỷ lệ E/S 0,2% -Tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1 v/w
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN
1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng: Protein 48,8% và khoáng 20,7%
2. Không cần xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu tôm ban đầu.
3. Yếu tố thời gian thủy phân, nhiệt độ, nồng độ enzyme ảnh hưởng tới quá trình thủy phân enzyme bằng Alcalase.Trong đó yếu tố thời gian là ảnh hưởng nhiều nhất.
4. Chế độ xử lý tối ưu khi sử dụng enzyme Alcalase là nhiệt độ 600C, thời gian 6 giờ, nồng độ enzyme 0,2%, tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1 (v/w). Ở chế độ thủy phân tối ưu hiệu suất khử protein là 92,4% và tương ứng với hàm lượng protein còn lại sau quá trình thủy phân là 8,86%.
ĐỀ SUẤT Ý KIẾN
Cần nghiên cứu thêm xác định, đánh giá chất lượng của chitin thu được theo phương pháp xử lý bằng enzyme
Nghiên cứu tận thu dịch protein sau khi xử lý bằng Alcalase.
Nghiên cứu tác động tới môi trường của quy trình kết hợp xử lý bằng enzyme
Từ kết quả nghiên cứu đạt được, tiếp tục triển khai thí nghiệm theo phương pháp kết hợp xử lý trên quy mô lớn hơn, tiến tới sản xuất trên quy mô công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1] Nguyễn Việt Dũng, (1999). Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và phương pháp bảo quản tôm nguyên liệu. Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Nha
Trang.
[2] Nguyễn Lệ Hà, (2009). Chuyên đề tiến sĩ, Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ đầu tôm sú (Penaeus monodon) vào chế biến thủy sản. Trường
Đại học Nha Trang.
[3] Đặng Thị Hiền, (2008). Nghiên cứu sử dụng enzyme protease trong quy trình sản xuất chitin-chitosan. Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Nha Trang.
[4] Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, (1997). Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản. Trường Đại học Nha Trang.
[5] Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền, (2005). Nghiên cứu thủy phân chitosan bằng acid hữu cơ và nghiên cứu phản ứng chitosan bằng acid Fomic và acid Acetic. Hội
nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ III, tr 210 – 221.
[6] Nguyễn Văn Lệ, (1996). Nghiên cứu sử dụng protease đầu tôm trong chế biến thủy sản. Luận án phó tiến sĩ khoa học, Đại học Khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội, Hà Nội.
[7]. Trần thị Luyến, (2004). Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp bộ sản xuất Chitin, Chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản. Mã số B2002-33-01-DA, 8-15.
[8] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, (1996). Công nghệ chế biến tổng hợp – tập 3. Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
[9] Trần Thị Luyến và Đỗ thị Bích Thủy, (2006). Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm. Tạp chí
KHCN Thủy Sản, Đại học Thủy sản, số 02, 47 – 55.
[10]. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2004). Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản – NXB Nông Nghiệp, 10 – 25.
[11]. Đỗ Văn Nam và cs, (2005). Nghiên cứu đánh giá hiện trạng môi trường các cơ sở chế biến thủy sản, đề xuất các giải pháp quản lí. Viện nghiên cứu Hải Sản.
[12] Nguyễn Minh Trí, Lương Thị Xuyến, Nguyễn Thị Thanh Hải, Đỗ Thị Ánh Hòa, (2009). Ép tách protein từ đầu tôm thẻ (Penaeus vannamei) trong sản xuất Chitin và bổ sung vào chượp trong sản xuất nước mắm. Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy Sản,
Trường Đại học Nha Trang.
[13] Nguyễn Hoàng Bảo Trung, (2010). Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân Protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng. Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang.
[14] Trang Sĩ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương, (2009). Chitin – chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng. NXB Nông
Nghiệp.
[15] Trang Sĩ Trung, (2007). Nghiên cứu kết hợp enzyme protease trong công nghệ sản xuất chitin từ phế liệu đầu vỏ tôm. Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản, số
3, Trường Đại học Nha Trang.
[16] Nguyễn Văn Truyền, (2006). Nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng xanh. Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Nha Trang.
Tài liệu nước ngoài
[17] AACC International., (2000). Approved Methods off the American Association of Cereal Chemists, 10th end. The American Association of Cereal Chemists, St
Paul, MN.
[18] AOAC., (1990). Official methods of analysis. Washington (DC). Association of Official Analytical Chemists.
[19] Alder – Nissen. J., (1986). Enzyme Hydrolysis of Food Protein. Elsevier Applied Science Publishers, New York.
[20] Holanda and Netto., (2006). Recovery of Components from shrimp (Xiphopenaeus kroyeri) Processing waste by enzymatic Hydrolysis. Journal of Food
Science, Vol.71, pp.1-6.
[21] Liaset et al,. (2002). Studies on the nitrogen recovery in enzymic hydrolysis of Atlanticsalmon (Salmo salar, L.) frames by Protamex™ protease. Process Biochemistry 3, pp. 1263–1269.
[22] Mizani. M., Aminlari. M., Khodabandeh. M., (2005). An effective method for producing a nutritive protein extract powder from shrimp – head waste. Food
Science and Technology International, Vol.11, No. 1, pp 49 – 54.
[23] No, H. K. and Meyers, S. P. (1997). Preparation of chitin and chitosan. Chitin handbook. [Eds.] Muzzarelli, R.A.A and Peter, M. G. Italy: Atec Edizioni, pp.475. [24] No. H. K, Meyers. SP, Lee. HS., (1989). Isolation and characterization of chitin from crawfish shell waste. J Agric Food Chem 37, pp. 9 – 575.
[25] Rao and Steven,. (2005). Chitin production by Lactobacillus fermentation of shrimp biowaste in a drum reactor and its chemical conversion to chitosan. Journal
of Chemical Technology and Biotechnology, 80, pp 1080 – 1087.
[26] Rebeca. B, Pena – Vera.MT, Diaz-Castaneda. M., (1991). Production of fissh
protein hydrolysates with bacterial proteases yield and nutritional value. J Food Sci
56, pp.14 – 309.
[27] Rupsankar Chakrabarti., (2002). Carotenoprotein from tropical brown shrimp shell waste by enzymatic process. Food Biotechnology, pp 81 - 90.
[28] Satya Sadhan Dey and Krushna Chandra Dora. (2011). Antioxidative activity of
protein hydrolysate produced by Alcalase hydrolysis from shrimp waste (Penaeus monodon and Penaeus indicus). Journal of Food Science and Technology DOI:
10.1007/s13197-011-0512-z
[29] Shahidi, F., & Synowiecki, J., (1991). Isolation and characterization of nutrients and value-added products from snow crab (Chinoecetes opilio) and shrimp (Pandalus borealis) processing discards. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 39, 1527–1532.
[30] Synowiecki and Al-Khateeb., (2000). The recovery of protein hydrolysate
during enzymatic isolation of Chitin from shrimp Cragon cragon processing discards. Journal of Food Chemistry, 68, pp. 147- 152.
[31] Trang Si Trung., (2010). Recovery of valuable components from shrimp waste. International Foundation for Science, Sweden, pp. 15 – 30.
Tài liệu web [32] http://vietrade.gov.vn/thu-hi-sn/2550-thuy-hai-san-the-gioi-2011-mot-nam- nhin-lai-phan-1.html [33] http://www.fistenet.gov.vn/f-thuong-mai-thuy-san/a-xuat-nhap-khau/toan-canh-xuat- khau-tom-nam-2011 [32] http://en.wikipedia.org/wiki/Response_surface_methodology [33] http://blogthuysan.blogspot.com/2011/10/su-bien-oi-cua-ong-vat-thuy-san-sau- khi.html
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kết quả khảo sát hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và việc bổ sung enzyme Alcalase theo mô hình General Factorial
Bảng 1: Ma trận thí nghiệm
Std Block Chế độ Hiệu suất khử protein
1 Ngày 1 CD1 88.79124 2 Ngày 2 CD1 90.88614 3 Ngày 3 CD1 88.95153 4 Ngày 1 CD2 92.1772 5 Ngày 2 CD2 92.37842 6 Ngày 3 CD2 92.18071 7 Ngày 1 CD3 81.90479 8 Ngày 2 CD3 84.75688 9 Ngày 3 CD3 82.14182 10 Ngày 1 CD4 91.59076 11 Ngày 2 CD4 92.45213 12 Ngày 3 CD4 91.52906 (Kết quả là giá trị 3 lần lặp, p<0.05)
Phụ lục 2: Kết quả xác định ảnh hưởng của các yếu tố tới hiệu quả khử protein bằng enzyme Alcalase
Bảng 1 Giá trị pH nguyên liệu trước và sau khi xử lý nhiệt
Lần đo 1 2 3 4 5 6 7 8
Không nhiệt 8,25 8,23 8,28 8,22 8,18 8,19 8,07 8,2
Có nhiệt 7,76 7,76 7,75 7,78 7,82 7,76 7,79 7,83
Phụ lục 3. Kết quả tối ưu theo mô hình Box Behnken Std X1: Thời gian (h) X2: Nhiệt độ (0C) X3: Nồng độ E/S (%) Y:
Hiệu quả khử protein (%)
1 3 50 0.25 84.753029 2 7 50 0.25 90.039012 3 3 70 0.25 87.836639 4 7 70 0.25 91.024062 5 3 60 0.1 87.29877 6 7 60 0.1 92.991061 7 3 60 0.4 90.854645 8 7 60 0.4 94.073286 9 5 50 0.1 83.985173 10 5 70 0.1 89.168249 11 5 50 0.4 90.839569 12 5 70 0.4 90.556284 13 5 60 0.25 91.868265 14 5 60 0.25 92.353529 15 5 60 0.25 92.77898
Phụ lục 5: Các phương pháp phân tích định lượng 1.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret
Dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh (ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipet), vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm
- Micropipet (100-1000µl) - Thiết bị đo UV-Vis Cary 100
Hóa chất
- NaOH - CuSO4.5H2O
- C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat) - BSA (Bovine serum albumin)
Tiến hành
Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375 gam CuSO4.5H2O và 8,0571 gam C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất .
Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0÷5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như trong bảng.
Bảng 3 Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn phương pháp Biuret
Ống nghiệm Hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (sử dụng ống 0 làm mẫu blank)
Bảng 4 Kết quả OD chạy đường chuẩn Biuret
Ống Hàm lượng protein (mg/ml) Giá trị OD 570 nm
0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10 0 0.0955 0.1895 0.2911 0.4037 0.4924
Phương trình đường chuẩn
Hình 2 Đường chuẩn cho phương pháp Biuret
Xử lý mẫu
Ngâm 3 – 5g nguyên liệu khô hoặc 3 – 10g nguyên liệu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15 (w/v), sau đó đem ủở 950C trong 6 giờ.
Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân không bằng giấy lọc Whatman Filter paper.
Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV-Vis mini1240. Lấy 1ml dịch lọc + 4ml thuốc thử Biuret, dùng máy Voltex lắc rồi chờ 30 phút để phản ứng xảy ra rồi đem đo ở bước sóng 570 nm.
Tính kết quả: Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch. Từ đó tính ra được phần trăm protein có trong mẫu theo công thức tính sau:
% protein = 100 / ) 100 .( 1000 . 100 . . Mc m C V
Trong đó: V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng (ml) C: Hàm lượng protein trong 1 ml (mg/ml) m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam) Mc: Độẩm của mẫu đem đi phân tích (%).
1.2 Phương pháp tính hiệu suất khử
Đầu tiên xác định hàm lượng protein có trong mẫu vỏ tôm ban đầu và hàm lượng protein có trong bã sau khi thủy phân. Kết quả được tính theo công thức sau:
X = x 100 (%) Trong đó:
X: hiệu suất khử protein
X1: Hàm lượng protein có trong mẫu nguyên liệu ban đầu X2: Hàm lượng protein có trong bã sau thủy phân
1.3 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số
Nguyên lý: Dùng sức nóng 600 – 6500C nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra % hàm lượng tro có trong nguyên liệu.
Tiến hành xác định: Nung chén xứ đã rửa sạch ở lò nung tới 6000C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng cốc trên cân phân tích
X1 – X2 X1
với độ chính xác 10-4, cho vào chén m (g) mẫu. Cân tất cả trên cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào lò nung ở nhiệt độ 6000C. Nung đến tro trắng nghĩa là loại hết các chất hữu cơ. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, rồi đem cân trên cân phân tích. Tính kết quả: X = (%) 1 100 ) 2 ( G G G G Trong đó: G: Trọng lượng cốc (g). G1: Trọng lượng cốc + mẫu (g). G2: Trọng lượng cốc + tro (g) 1.4 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm
Độẩm được xác định bằng phương pháp sấy khô.
Nguyên lý: Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong nguyên liệu. Cân trong lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô. Từ đó tính ra phần trăm (%) nước có trong nguyên liệu.
Tiến hành xác định: Lấy cốc sấy cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105C đến trọng lượng không đổi, sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội và cân phân tích. Sau đó, cho vào cốc khoảng m (g) mẫu đã chuẩn bị sẵn cân trên cân phân tích với độ chính xác 10-4, cho tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 105÷110C đến khối lượng không đổi, sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút rồi đem cân trên cân phân tích. Từ đó xác định hàm lượng ẩm. Tính kết quả: X = (%) 1 100 ) 2 1 ( G G G G Trong đó: G: Trọng lượng cốc (g). G1: Trọng lượng cốc + mẫu (g).
Phụ lục 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ THIẾT BỊ PHÂN TÍCH
Đầu tôm thẻ chân trắng Đầu tôm phơi khô sau khi thủy phân
Thủy phân protein bằng Alcalase Thiết bị cân phân tích
Thiết bị UV-VIS CARY 100 Thiết bị ổn nhiệt Memmert