Kết quả đánh giá hiệu quả khử protein theo thí nghiệm bố trí ở mục 2.2.4 được trình bày ở bảng 2.2. Phân tích số liệu thí nghiệm trên phần mềm Design Expert 7.0 cho kết quả về ảnh hưởng của các nhân tố tới khả năng hoạt động của Alcalase như trong hình 3.2 và hình 3.3.
Hình 3.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng hoạt động của Alcalase
Hình 3.3 Đồ thị Half normal về ảnh hưởng của các nhân tố tới hiệu quả khử protein
Yếu tố thời gian thủy phân có mức độ ảnh hưởng lớn nhất (62,58%) cho thấy kéo dài hay rút ngắn thời gian ảnh hưởng sẽ có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu suất thủy phân protein.
Yếu tố nhiệt độ và tỷ lệ enzyme bổ sung vào nguyên liệu có mức độ ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein gần như nhau lần lượt là 7,98% và 6,37%.
Hình 3.4 Đồ thị về sự tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ Enzyme/nguyên liệu
Ở nhiệt độ thấp và tỷ lệ enzyme/nguyên liệu thấp, thời gian tăng thì hiệu quả khử protein càng tăng. Tuy nhiên chỉ trong khoảng thời gian từ 2 – 7 giờ đầu thì tốc độ phản ứng tăng nhanh, hiệu suất tăng nhưng sau gần 8 giờ thì hiệu suất có xu hướng tăng chậm lại và giảm dần (Hình 3.4). Điều này có thể do thời gian thủy phân kéo dài, một số enzyme, amino acid tiếp tục bị thủy phân chuyển thành các sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol gây mùi khó chịu, vì vậy nên dừng phản ứng thủy phân ở giai đoạn này.
Khi càng tăng nồng độ enzyme thì hàm lượng protein tách được càng nhiều do lúc này enzyme tương tác lên liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn .Theo Alder – Nissen (1986) các nhóm amino tự do (-NH2) hình thành trong quá trình thủy phân có thể phản ứng trực tiếp với protein để thủy phân các liên kết peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion R-COO- và cation R- NH3
+
. Vì vậy các amino tự do cùng hỗ trợ cho sự cắt mạch protein. Tuy nhiên, nồng độ enzyme càng cao thì việc tăng nhiệt độ thủy phân thì hiệu suất tách protein không có sự khác biệt lớn (Hình 3.4). Trong khi đó enzyme Alcalase lại có giá thành rất đắt từ đó kéo theo giá thành sản phẩm đắt theo.
Nồng độ enzyme có ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein nhưng mức độ ảnh hưởng thấp hơn so với thời gian và nhiệt độ thủy phân. Điều này có thể giải thích là do enzyme nội tại trong đầu tôm hoạt động rất mạnh. Như trong hình 3.1 dù không bổ sung enzyme nhưng hiệu suất khử protein lên tới 89,54% còn sử dụng enzyme thì hiệu suất đạt 91,86%. Nhưng do hàm lượng protein còn lại trong bã của phương pháp không bổ sung enzyme còn rất cao 12% so với 9% của phương pháp bổ sung enzyme nên việc bổ sung enzyme là cần thiết và trong nghiên cứu tiếp theo bổ sung enzyme với nồng độ 0,1 – 0,4% để xác định thông số tối ưu cho quá trình tách protein bằng enzyme Alcalase.
Ở giai đoạn đầu của quá trình thủy phân, hệ enzyme protease ở đầu tôm và enzyme Alcalase hoạt động mạnh sẽ tác động lên liên kết nhị dương của phân tử protein, protein tách được ra nhiều kèm theo sự giảm pH rất nhanh. Sau 5 giờ thủy phân hàm lượng protein tách được đã đạt trên 90%. Ở các giờ tiếp theo hàm lượng protein tách được tiếp tục tăng nhưng mức độ chậm dần. Sau 8 giờ tách được rất ít. Xu hướng này phù hợp với nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2002) và Đặng Thị Hiền (2008) rằng khi tăng thời gian thủy phân dẫn đến hình thành nhiều peptid và các amino acid nhỏ trực tiếp tấn công vào phân tử chitin ngăn cản sự tiếp xúc của enzyme với các phân tử protein liên kết với chitin từ đó giảm hiệu quả thủy phân của enzyme. Hơn nữa, theo Rebeca và cộng sự (1991) cho rằng các hợp chất hình thành trong suốt quá trình thủy phân hay các peptid có khả năng hòa tan, nó hoạt động như cơ chất cạnh tranh với protein thủy phân dẫn đến làm giảm tốc độ thủy phân. Cũng theo Nguyễn Hoàng Bảo Trung (2010) thì chế độ thủy phân tốt nhất là 600C cũng chỉ nên thực hiện trong 3,5 giờ, vì sau đó lượng acid amin hình thành tương đối chậm lại chứng tỏ khả năng xúc tác phản ứng của hệ enzyme nội tại trong đầu tôm yếu dần do bắt đầu bị ức chế khi ở nhiệt độ cao. Như vậy, khi tăng thời gian thì hiệu quả khử protein tăng nhưng kéo dài quá 8 giờ thì hiệu quả tăng chậm và không đáng kể so với 7 giờ (Hình 3.4), kéo theo đó là chi phí sản xuất tăng.
Vì vậy trong nghiên cứu tiếp theo khảo sát và tối ưu quá trình khử protein bằng enzyme Alcalase thời gian thủy phân từ 3 – 7 giờ.
Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian tới hiệu quả khử protein
Để thăm dò nhiệt độ thích hợp tiến hành thủy phân trong dải nhiệt độ 50 – 700C, các mẫu được thực hiện song song trong các điều kiện đã xác định ở trên. Nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước chỉ ra nhiệt độ thích hợp của enzyme Alcalase là 50 – 600C. Theo kết quả nghiên cứu của Holanda và Netto (2006) và Đặng Thị Hiền (2008), nhiệt độ thủy phân thích hợp là 550C. Trong nghiên cứu của Trang Sĩ Trung sử dụng enzyme Flavourzyme thủy phân protein trong phế liệu đầu vỏ tôm thì nhiệt độ thích hợp là 500C. Tuy nhiên khác so với nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2002), theo tác giả nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 600C. Điều này có thể giải thích là loài tôm, môi trường sống, mùa vụ ảnh hưởng tới nhiệt độ thích hợp của enzyme nội tại. Ngoài ra, mỗi loại nguyên liệu có thành phần enzyme nội tại khác nhau và phương pháp nghiên cứu khác nhau (có hoặc không sử dụng enzyme nội tại trong nguyên liệu khi bổ sung enzyme từ bên
ngoài vào) nên nhiệt độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ tối ưu cho cả hệ enzyme nhằm đạt được hiệu suất thủy phân cao nhất.
Thịt động vật thủy sản rất dễ bị thối rữa. Tốc độ thối rữa tỉ lệ thuận với nhiệt độ. Tốc độ thối rữa nhanh :nhiệt độ từ 25-350C. Dưới 150C thì tốc độ giảm xuống rõ rệt. Khi nhiệt độ tăng lên quá phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ thối cũng giảm xuống [44]. Theo Nguyễn Hoàng Bảo Trung (2010) nhiệt độ tối thích của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng là 600C, tại nhiệt độ này cũng là nhiệt độ không thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật thối rữa nên khi thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme ở nhiệt độ này sẽ không hư hỏng sớm. Tuy nhiên không nên tăng nhiệt độ lên cao quá 700C dễ làm biến tính enzyme dẫn đến hoạt tính protease giảm. Vì vậy trong nghiên cứu tiếp theo sử dụng khoảng nhiệt độ 50 – 700C để đánh giá và tìm chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm.
Để thăm dò thời gian thủy phân bằng Alcalase thích hợp tiến hành thủy phân trong khoảng thời gian 2 – 8 giờ, các mẫu được thực hiện song song trong các điều kiện đã xác định ở trên.