Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu. Số liệu báo cáo là kết quả trung bình của 3 lần lặp đó.
Kết quả được phân tích và xử lý trên phần mềm Excel 2007 và phần mềm Design Expert 7.0 (Stat-Ease, Inc.) với ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%,
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
Để đánh giá được chất lượng và hiệu suất thu hồi protein và chitin cần xác định thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng dùng làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
STT Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng
1 Độ ẩm (%) 78,32 ± 1,35
2 Hàm lượng Khoáng* (%) 20,70 ± 0,65 3 Hàm lượng Protein* (%) 49,80 ± 0,92 (*) Tính theo hàm lượng chất khô
Kết quả phân tích cho thấy phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng có độ ẩm rất cao tới 78,32%, tiếp đó là hàm lượng protein thô tới 49,80% theo trọng lượng khô, hàm lượng khoáng cũng tương đối cao tới 20,70%. Do đó, cần có phương pháp loại bỏ bớt thành phần protein trong nguyên liệu trước khi đưa vào sản xuất.
So sánh với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Trí và cộng sự (2009) thành phần khoáng của nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng trước khi ép là 20,8% thì không có sự khác biệt lớn. Kết quả này thấp hơn trong nghiên cứu của TS.Trang Sĩ Trung (2010) thì hàm lượng protein trên đầu là 50 – 53% theo trọng lượng khô và hàm lượng khoáng là 24,6%. Thành phần protein của loại tôm này cao hơn trong quy trình xử lý phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri 39,42% (Holanda and Netto,
2006). Sự khác biệt về kết quả giữa các nghiên cứu có thể là do phế liệu tôm ở những khu vực khác nhau có thành phần hóa học khác nhau hoặc cùng một loài nhưng tùy thuộc giai đoạn sinh trưởng, trạng thái dinh dưỡng, mùa vụ khác nhau mà thành phần hóa học khác nhau… Như vậy, đầu tôm thẻ chân trắng thích hợp cho việc nghiên cứu thu hồi, sản xuất protein và chitin, đồng thời nên có hướng tận thu dịch protein sau thủy phân góp phần giảm ô nhiễm môi trường, tăng hiệu quả kinh tế.
3.2 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme Alcalase được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung Alcalase đến hiệu quả khử protein. Chữ cái a, b, c, d khác nhau trên các
cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với p < 0,05.
Kết quả trên cho thấy việc không xử lý nhiệt nguyên liệu tươi ban đầu cho hiệu quả khử protein cao hơn so với việc xử lý nhiệt. Kết quả này có thể được giải thích do enzyme nội tại trong đầu tôm hoạt động rất mạnh. Cũng như tất cả các động vật thủy sản khác, protease nội bào tập trung chủ yếu ở cơ quan tiêu hóa, sau đến cơ quan nội tạng và cơ thịt. Đối với tôm, do cơ quan tiêu hóa và nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều ở đầu nhất. Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt tiêu hóa protein của giáp xác và nhất là tôm rất giống với enzyme nội tạng có trong dạ dày cá. Chúng tồn tại chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astaxin, collagenase…
Trong các nghiên cứu trước đây về hệ enzyme protease trong tôm cũng chỉ ra rằng enzyme protease ở tôm không những bao gồm nhiều loại khác nhau, mà còn có
CD1: không nhiệt - không enzyme CD2: không nhiệt - có enzyme CD3: có nhiệt - không enzyme CD4: có nhiệt - có enzyme
đặc tính của hệ thay đổi khi tách chiết từ các loài tôm khác nhau. Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 600C và 500C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5. Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá. Enzyme protease từ đầu tôm càng xanh có nhiệt độ thích hợp là 550C, pH tối thích là 8,0 (Nguyễn Văn Truyền, 2006). Hệ enzyme protease từ đầu tôm sú
Penaeus monodon, bền nhiệt, nhiệt độ tối thích là 620C, thuộc nhóm protease serine, trong đó có các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động (Nguyễn Lệ Hà, 2009).
Bên cạnh đó việc xử lý nhiệt nguyên liệu tươi ban đầu cũng ảnh hưởng tới giá trị pH. Kết quả theo dõi cho thấy giá trị pH của mẫu có xử lý nhiệt dao động ở 8,20 trong khi với mẫu không xử lý nhiệt thì giá trị pH là 7,78 (Bảng 1, Phụ lục 2).
Kết quả nghiên cứu giá trị pH và hiệu quả khử khi không xử lý nhiệt cao hơn khi có xử lý nhiệt lần lượt là 89,54% và 82,93%. Chứng tỏ pH của enzyme Alcalase và enzyme nội tại ở đầu tôm chủ yếu thuộc nhóm enzyme protease kiềm yếu.
pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng ion hóa của enzyme, cơ chất và độ nhớt của môi trường … từ đó ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme, vì vậy ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng thủy phân. Tại pH tối ưu thì enzyme hoạt động mạnh, tốc độ phản ứng tăng. Khi pH quá cao hay quá thấp đều gây biến tính protein và enzyme dẫn đến ức chế hoạt động xúc tác của enzyme, từ đó làm giảm tốc dộ phản ứng thủy phân.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng (1999), hệ protease trong đầu tôm hoạt động ở pH nghiêng về môi trường kiềm. Khi tăng pH lớn hơn 8,0 thì protein tách được so với ban đầu giảm dần 81,6 – 71,7%. Nguyên nhân là do bản chất của enzyme là một protein mang tính chất lưỡng tính, khi pH môi trường thay đổi đồng nghĩa với nồng độ H+ trong môi trường thay đổi, sẽ tác động tới cấu trúc của phân tử enzyme đưa pH của enzyme về gần giá trị pH điểm đẳng điện ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme (Phạm Thị Trân Châu, 1999). Tác giả Đặng Thị Hiền cũng cho
rằng enzyme Alcalase thể hiện hoạt tính cao nhất ở pH 8,0 nên càng gần mức pH 8,0 hàm lượng protein tách được càng cao, đồng thời cũng là môi trường thuận lợi cho hoạt động của hệ enzyme có sẵn trong phế liệu tôm. Và hiệu suất tách protein tại pH 8,5 chênh lệch không quá nhiều so với tại pH 8,0 lần lượt là 81,6% và 84,5%.
Theo Satya Sadhan Dey và Krushna Chandra Dora (2011) thì việc xử lý nhiệt nguyên liệu tươi ban đầu lại là cần thiết vì những enzyme nội tại trong nguyên liệu gây ra hiện tượng biến đen, tạo mùi ươn thối và gây hư hỏng cho nguyên liệu. Kết quả này có sự khác biệt có thể do nguyên vật liệu và phương pháp thí nghiệm khác nhau.
Từ kết quả phân tích trên lựa chọn:
Không xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu để lợi dụng những enzyme nội tại có ích khử một phần protein trong phế liệu đầu tôm, đồng thời giảm chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm,
Bổ sung enzyme Alcalase để tăng hiệu suất thu hồi protein và chitin.
3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein
Kết quả đánh giá hiệu quả khử protein theo thí nghiệm bố trí ở mục 2.2.4 được trình bày ở bảng 2.2. Phân tích số liệu thí nghiệm trên phần mềm Design Expert 7.0 cho kết quả về ảnh hưởng của các nhân tố tới khả năng hoạt động của Alcalase như trong hình 3.2 và hình 3.3.
Hình 3.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng hoạt động của Alcalase
Hình 3.3 Đồ thị Half normal về ảnh hưởng của các nhân tố tới hiệu quả khử protein
Yếu tố thời gian thủy phân có mức độ ảnh hưởng lớn nhất (62,58%) cho thấy kéo dài hay rút ngắn thời gian ảnh hưởng sẽ có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu suất thủy phân protein.
Yếu tố nhiệt độ và tỷ lệ enzyme bổ sung vào nguyên liệu có mức độ ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein gần như nhau lần lượt là 7,98% và 6,37%.
Hình 3.4 Đồ thị về sự tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ Enzyme/nguyên liệu
Ở nhiệt độ thấp và tỷ lệ enzyme/nguyên liệu thấp, thời gian tăng thì hiệu quả khử protein càng tăng. Tuy nhiên chỉ trong khoảng thời gian từ 2 – 7 giờ đầu thì tốc độ phản ứng tăng nhanh, hiệu suất tăng nhưng sau gần 8 giờ thì hiệu suất có xu hướng tăng chậm lại và giảm dần (Hình 3.4). Điều này có thể do thời gian thủy phân kéo dài, một số enzyme, amino acid tiếp tục bị thủy phân chuyển thành các sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol gây mùi khó chịu, vì vậy nên dừng phản ứng thủy phân ở giai đoạn này.
Khi càng tăng nồng độ enzyme thì hàm lượng protein tách được càng nhiều do lúc này enzyme tương tác lên liên kết nhị dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn .Theo Alder – Nissen (1986) các nhóm amino tự do (-NH2) hình thành trong quá trình thủy phân có thể phản ứng trực tiếp với protein để thủy phân các liên kết peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion R-COO- và cation R- NH3
+
. Vì vậy các amino tự do cùng hỗ trợ cho sự cắt mạch protein. Tuy nhiên, nồng độ enzyme càng cao thì việc tăng nhiệt độ thủy phân thì hiệu suất tách protein không có sự khác biệt lớn (Hình 3.4). Trong khi đó enzyme Alcalase lại có giá thành rất đắt từ đó kéo theo giá thành sản phẩm đắt theo.
Nồng độ enzyme có ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein nhưng mức độ ảnh hưởng thấp hơn so với thời gian và nhiệt độ thủy phân. Điều này có thể giải thích là do enzyme nội tại trong đầu tôm hoạt động rất mạnh. Như trong hình 3.1 dù không bổ sung enzyme nhưng hiệu suất khử protein lên tới 89,54% còn sử dụng enzyme thì hiệu suất đạt 91,86%. Nhưng do hàm lượng protein còn lại trong bã của phương pháp không bổ sung enzyme còn rất cao 12% so với 9% của phương pháp bổ sung enzyme nên việc bổ sung enzyme là cần thiết và trong nghiên cứu tiếp theo bổ sung enzyme với nồng độ 0,1 – 0,4% để xác định thông số tối ưu cho quá trình tách protein bằng enzyme Alcalase.
Ở giai đoạn đầu của quá trình thủy phân, hệ enzyme protease ở đầu tôm và enzyme Alcalase hoạt động mạnh sẽ tác động lên liên kết nhị dương của phân tử protein, protein tách được ra nhiều kèm theo sự giảm pH rất nhanh. Sau 5 giờ thủy phân hàm lượng protein tách được đã đạt trên 90%. Ở các giờ tiếp theo hàm lượng protein tách được tiếp tục tăng nhưng mức độ chậm dần. Sau 8 giờ tách được rất ít. Xu hướng này phù hợp với nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2002) và Đặng Thị Hiền (2008) rằng khi tăng thời gian thủy phân dẫn đến hình thành nhiều peptid và các amino acid nhỏ trực tiếp tấn công vào phân tử chitin ngăn cản sự tiếp xúc của enzyme với các phân tử protein liên kết với chitin từ đó giảm hiệu quả thủy phân của enzyme. Hơn nữa, theo Rebeca và cộng sự (1991) cho rằng các hợp chất hình thành trong suốt quá trình thủy phân hay các peptid có khả năng hòa tan, nó hoạt động như cơ chất cạnh tranh với protein thủy phân dẫn đến làm giảm tốc độ thủy phân. Cũng theo Nguyễn Hoàng Bảo Trung (2010) thì chế độ thủy phân tốt nhất là 600C cũng chỉ nên thực hiện trong 3,5 giờ, vì sau đó lượng acid amin hình thành tương đối chậm lại chứng tỏ khả năng xúc tác phản ứng của hệ enzyme nội tại trong đầu tôm yếu dần do bắt đầu bị ức chế khi ở nhiệt độ cao. Như vậy, khi tăng thời gian thì hiệu quả khử protein tăng nhưng kéo dài quá 8 giờ thì hiệu quả tăng chậm và không đáng kể so với 7 giờ (Hình 3.4), kéo theo đó là chi phí sản xuất tăng.
Vì vậy trong nghiên cứu tiếp theo khảo sát và tối ưu quá trình khử protein bằng enzyme Alcalase thời gian thủy phân từ 3 – 7 giờ.
Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian tới hiệu quả khử protein
Để thăm dò nhiệt độ thích hợp tiến hành thủy phân trong dải nhiệt độ 50 – 700C, các mẫu được thực hiện song song trong các điều kiện đã xác định ở trên. Nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước chỉ ra nhiệt độ thích hợp của enzyme Alcalase là 50 – 600C. Theo kết quả nghiên cứu của Holanda và Netto (2006) và Đặng Thị Hiền (2008), nhiệt độ thủy phân thích hợp là 550C. Trong nghiên cứu của Trang Sĩ Trung sử dụng enzyme Flavourzyme thủy phân protein trong phế liệu đầu vỏ tôm thì nhiệt độ thích hợp là 500C. Tuy nhiên khác so với nghiên cứu của Synowiecki và Al-Khateeb (2002), theo tác giả nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 600C. Điều này có thể giải thích là loài tôm, môi trường sống, mùa vụ ảnh hưởng tới nhiệt độ thích hợp của enzyme nội tại. Ngoài ra, mỗi loại nguyên liệu có thành phần enzyme nội tại khác nhau và phương pháp nghiên cứu khác nhau (có hoặc không sử dụng enzyme nội tại trong nguyên liệu khi bổ sung enzyme từ bên
ngoài vào) nên nhiệt độ thủy phân tối ưu là nhiệt độ tối ưu cho cả hệ enzyme nhằm đạt được hiệu suất thủy phân cao nhất.
Thịt động vật thủy sản rất dễ bị thối rữa. Tốc độ thối rữa tỉ lệ thuận với nhiệt độ. Tốc độ thối rữa nhanh :nhiệt độ từ 25-350C. Dưới 150C thì tốc độ giảm xuống rõ rệt. Khi nhiệt độ tăng lên quá phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ thối cũng giảm xuống [44]. Theo Nguyễn Hoàng Bảo Trung (2010) nhiệt độ tối thích của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng là 600C, tại nhiệt độ này cũng là nhiệt độ không thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật thối rữa nên khi thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme ở nhiệt độ này sẽ không hư hỏng sớm. Tuy nhiên không nên tăng nhiệt độ lên cao quá 700C dễ làm biến tính enzyme dẫn đến hoạt tính protease giảm. Vì vậy trong nghiên cứu tiếp theo sử dụng khoảng nhiệt độ 50 – 700C để đánh giá và tìm chế độ tối ưu cho quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm.
Để thăm dò thời gian thủy phân bằng Alcalase thích hợp tiến hành thủy phân trong khoảng thời gian 2 – 8 giờ, các mẫu được thực hiện song song trong các điều kiện đã xác định ở trên.
3.4 Tối ưu công đoạn tách protein của đầu tôm bằng Alcalase
Sau khi phân tích mức độ ảnh hưởng các yếu tố tới quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng enzyme Alcalase ở trên miền nghiên cứu để tối ưu quá trình khử protein được xác định:
- Tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu: 0,1 – 0,4%. - Nhiệt độ phản ứng: 50 – 700C. - Thời gian thủy phân: 3 – 7 giờ.
Hình 3.6 Đánh giá mức độ phù hợp của phương trình
Kết quả cho thấy mô hình phù hợp với phân phối chuẩn và được đề nghị thiết kế theo phương trình bậc 2.
Dựa vào kết quả ANOVA cho thấy mô hình là phù hợp với phân phối chuẩn. Giá trị p-value nhỏ hơn 0,05 cho biết mô hình là có ý nghĩa. Giá trị lớn hơn 0,100 chỉ ra sự không có ý nghĩa của các biến. Trong mô hình thì A, B, C, BC, B2 là có ý nghĩa. Giá trị Lack of fit cho thấy mô hình là đầy đủ tuy nhiên hệ số Adj R2 = 0,95 và Pred R2 = 0,76 (chênh lệch lớn hơn 0,2) cho thấy sự không phù hợp giữa mô hình