kiện nuôi cấy
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rất nhiều đối với quá trình sinh trƣởng và hình thành các sản phẩm của vi sinh vật. Thành phần dinh dƣỡng quá cao hay quá thấp cũng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và hình thành sản phẩm của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 là cần thiết.
3.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon
Cacbon là nguồn vật chất cung cấp cho quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt quá trình biến hoá phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Cacbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lƣợng khô của tế bào. Trong quá trình sinh hóa nguồn cacbon còn sinh ra năng lƣợng cần thiết cho quá
trình hoạt động của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn
cacbon duy nhất hay chủ yếu để sinh trƣởng, khi đó nguồn cacbon không phải là nguồn sinh năng lƣợng.
Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn cacbon. Đƣờng nói chung là nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng tốt cho vi sinh vật. Nhƣng tuỳ từng loại đƣờng mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ
trong môi trƣờng chứa glucoza và galactoza thì vi khuẩn Escherichia coli sử
dụng trƣớc glucoza (gọi là nguồn Cacbon tốc hiệu) còn galactoza đƣợc sử dụng sau (gọi là nguồn cacbon trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp ngƣời ta sử dụng nguồn cacbon chủ yếu là glucoza, saccharoza, rỉ đƣờng (phụ phẩm của nhà máy đƣờng) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn xenluloza tự nhiên hay dịch thuỷ phân xenluloza. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên sinh trƣởng của chủng TN2 Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, trên cả 4 nguồn cacbon sử dụng để nghiên cứu chủng vi khuẩn TN2 đều sinh trƣởng tốt. Sự sinh trƣởng của chủng vi khuẩn này đều tuân theo quy luật nhƣ sau: chủng TN2 sinh trƣởng mạnh trong khoảng từ 0 – 24h (mật độ ở tất cả các nguồn cacbon đều đạt khoảng
109CFU/ml). Từ 24 – 48h tốc độ sinh trƣởng của chủng TN2 bắt đầu giảm
dần và mật độ cực đại đạt đƣợc ở 48h (dao động trong khoảng từ 109 –
1010CFU/ml). Sau 48h mật độ ở tất cả các phƣơng án thí nghiệm đều có xu
hƣớng giảm hoặc đi vào giai đoạn ổn định. Qua đó cho thấy, nguồn cacbon không có ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TN2.
Bên cạnh khả năng sinh trƣởng để đánh giá ảnh hƣởng của nguồn cacbon cần phải đánh giá thông qua khả năng cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2 Thời gian nuôi cấy (h) Hàm lƣợng NH+
4 trong dịchnuôi cấy, (mg/l)
ĐC Glucoza Sacaroza Lactoza Manitol
24 0 0,22 0,6 1,5 0,99
48 0 0,32 0,99 1,92 1,5
72 0 0,55 1,12 1,23 1,11
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy ở các
phƣơng án thí nghiệm có sự biến động khác nhau.
Đối với nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hàm lƣợng NH+
4 tăng từ 24
– 72h và đều cao hơn so với ĐC. Hàm lƣợng NH+
4 đạt cực đại đạt 0,55mg/l
đối với glucoza và 1,12mg/l đối với sacaroza.
Với nguồn lactoza và manitol hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy tăng
từ 24 – 48 h và giảm 48 – 72h. Hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy cực đại
đạt là 1,92mg/l đối với lactoza và 1,5mg/l đối với manitol.
Tại sao hàm lƣợng NH+4 trong dịch nuôi cấy trên 2 nguồn lactoza,
manitol giảm trong khoảng 48 – 72h còn trên 2 nguồn glucoza và sacaroza vẫn tăng trong giai đoạn này. Điều này có thể lý giải nhƣ sau: đối với nguồn cacbon lactoza và manitol trong giai đoạn 48 – 72 h mật độ tế bào có xu hƣớng giảm mạnh hơn so với nguồn glucoza và sacaroza dẫn đến giảm tốc độ cố định nitơ. Hơn nữa sau 48h nguồn dinh dƣỡng trong dịch nuôi cấy đã giảm có thể làm ức chế khả năng cố định nitơ của vi khuẩn và hơn nữa khi nguồn dinh dƣỡng của môi trƣờng đã giảm các vi sinh vật có xu hƣớng sử dụng các
sản phẩm do mình tạo ra để duy trì sự sống. Vì vậy, dẫn đến hàm lƣợng NH+4
ở 2 nguồn lactoza và manitol tại 72h giảm so với 48h khoảng 26 – 35,9%. Còn đối với nguồn glucoza và sacaroza trong giai đoạn từ 48h – 72h mật độ có xu hƣớng ổn định và hơi tăng. Do mật độ vẫn đƣợc duy trì nên hoạt tính cố định nitơ không giảm mà còn tăng. Tuy nhiên, khi so sánh hoạt tính cố định nitơ trên nguồn lactoza và manitol vẫn cao hơn so với nguồn glucoza và sacaroza. Điều này cho thấy nguồn lactoza và nguồn manitol vừa có khả năng kích thích sinh trƣởng vừa có khả năng kích thích hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2. Khi so sánh hoạt tính cố định nitơ trên 4 nguồn cacbon cho thấy, nguồn lactoza cho hoạt tính cố định nitơ cao nhất (đạt 1,92mg/l) cao hơn so với nguồn manitol 21,8%, nguồn sacaroza 41,6%, nguồn glucoza 71,4%. Vì vậy, sẽ lựa chọn nguồn lactoza làm nguồn đƣờng thích hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo của chủng vi khuẩn TN2.
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon
Để tối ƣu hóa cho quá trình nhân giống phục vụ sản xuất, bên cạnh lựa chọn nguồn đƣờng hay nguồn cacbon chúng ta cần quan tâm đến ảnh hƣởng của nồng độ. Sau đây là kết quả nghiên ảnh hƣởng của nồng độ lactoza lên khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt tính của chủng vi khuẩn TN2.
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, ở mỗi nồng độ lactoza khác nhau chủng TN2 có quy luật sinh trƣởng khác nhau.
Với nồng độ lactoza 1%, chủng TN2 sinh trƣởng nhanh từ 0 – 24h, từ 24 – 48h gần nhƣ ổn định không có sự biến động nhiều về mật độ và sau 48h mật độ có xu hƣớng giảm. Điều này có thể giải thích nhƣ sau, ở nồng 1% lactoza nguồn dinh dƣỡng cacbon thấp, nên trong khảng thời gian từ 24-48h tốc độ sinh trƣởng chậm lại, sau 48h mật độ giảm mạnh do nguồn dinh dƣỡng cacbon trong môi trƣờng đã cạn kiệt.
Với nồng độ lactoza từ 1,5 – 2,5%: Chủng TN2 sinh trƣởng nhanh trong giai đoạn 0 – 24h, từ 24 – 48h tốc độ sinh trƣởng đã giảm nhƣng mật độ tế bào vẫn cao hơn so với nồng độ lactoza 1%, từ 48 – 72h mật độ tế bào giảm (pha suy vong).
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ lactoza lên sinh trƣởng của chủng TN2 Ở nồng độ 3% lactoza (nồng độ cacbon cao nhất), mật độ vi khuẩn có xu hƣớng tăng theo thời gian từ 0 – 72h, nhƣng mật độ tại các thời điểm 24h và 48h vẫn thấp hơn so với ở nồng độ 1,5 – 2,5%. Điều này có thể lý giải nhƣ sau, trong giai đoạn 0 – 48h do nồng độ lactoza trong môi trƣờng nuôi cấy quá cao dẫn đến ức chế khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn TN2. Theo thời gian nuôi cấy nồng độ lactoza trong môi trƣờng giảm dần, nhƣng nguồn cacbon còn lại vẫn đảm bảo đủ cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn. Do đó, dù sau 48h mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn lactoza 3% vẫn tăng. Nhƣng mật độ vi khuẩn của thí nghiệm này vẫn thấp hơn so với các thí nghiệm có nồng độ lactoza từ 1,5 – 2,5%. Qua đó cho thấy, khi nồng độ của lactoza lớn hơn 2,5% sẽ làm chậm quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn TN2.
Từ các kết quả trên cho thấy nồng độ của lactoza 2% sẽ là nồng độ thích hợp nhất cho sinh trƣởng của chủng TN2.
Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ lactoza lên chủng vi khuẩn TN2 thông qua hoạt tính cố định nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ lactoza đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2
Thời gian (h)
Hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy, (mg/l)
1% 1.5% 2% 2.5% 3%
24 0,36 0,56 1,49 1,16 0,5
48 0,42 1,02 1,95 1,54 0,74
72 0,46 0,94 1,78 1,34 0,93
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, với các nồng độ lactoza khác nhau thì khả năng cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 cũng khác nhau.
Ở nồng độ 1% hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2 gần nhƣ không
thay đổi trong thời gian nuôi từ 24 – 72h, hàm lƣợng NH+
4 trong dịch nuôi
cấy đạt từ 0,36 – 0,46mg/l. Ở nồng độ này hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2 thấp nhất so với các nồng độ đã nghiên cứu. Từ kết quả về mật độ, hoạt tính cố định nitơ ở nồng độ lactoza 1% cho thấy, nếu nguồn cacbon quá thấp sẽ ảnh hƣởng tới sinh trƣởng và quá trình cố định nitơ của chúng.
Đối với nồng độ lactoza 3% hoạt tính cố định nitơ của TN2 tăng trong
thời gian nuôi từ 24 – 72h. Tuy nhiên, hàm lƣợng NH+4 trong dịch nuôi cấy
đạt cao là 0,93mg/l. Điều này cũng cho thấy rằng với nồng độ lactoza quá cao sẽ ức chế quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn trong giai đoạn đầu đồng thời và ức chế cả quá trình cố định nitơ của chủng TN2.
Với nồng độ lactoza từ 1,5 – 2,5% quá trình cố định nitơ của chủng TN2 biến động theo quy luật tăng 24 – 48h, giảm 48 – 72h và ở nồng độ 2%
cho hoạt tính cố định nitơ cao nhất (hàm lƣợng NH+4 trong dịch nuôi cấy đạt
1,95mg/l). So sánh kết quả về mật độ tế bào và hoạt tính cố định nitơ ở các nồng độ thí nghiệm khách nhau cho thấy, ở nồng độ lactoza 2% chủng vi khuẩn TN2 vừa sinh trƣởng tốt nhất vừa cho hoạt tính cố định nitơ cao nhất. Vì vậy, nồng độ lactoza 2% là nồng độ thích hợp nhất cho chủng TN2 sinh trƣởng và cố định nitơ, nên nồng độ này sẽ đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Bên cạnh nguồn cacbon, nguồn nitơ cũng là một trong những thành phần dinh dƣỡng quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật. Vì vậy, đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới sự sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các nguồn nitow lên sinh trƣởng của chủng TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.6.
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, nguồn nitơ khác nhau ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TN2. Trong các nguồn
nitơ sử dụng để nghiên cứu, thì KNO3 là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh
trƣởng của chủng TN2, mật độ cực đại ≥ 1010
CFU/ml sau 48h nuôi cấy. Muối
(NH4)2SO4, cũng cho khả năng sinh trƣởng tốt hƣng kém hơn so với KNO3,
mật độ tế bào đạt cao nhất sau 24 h nuôi cấy (109CFU/ml). Chủng TN2 sinh
trƣởng yếu nhất trong môi trƣờng có muối NH4H2PO4 là nguồn cung cấp
nitơ, mật độ tế bào đạt cực đại < 109
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên sinh trƣởng của chủng TN2 Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.8.
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy, nguồn nitơ có tác động đến hoạt tính cố định
nitơ khác so với quá trình sinh trƣởng. Đối với nguồn KNO3 cho khả năng
sinh trƣởng tốt nhất, nhƣng hoạt tính cố định nitơ lại kém nhất. Hàm lƣợng
NH+4 trong dịch nuôi cấy có KNO3 giảm từ 22,001 – 65,56% so với môi
trƣờng cơ sở. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: KNO3 kích thích tế bào phân
chia liên tục nên tế bào sau khi trƣởng thành thì lại phân chia luôn và không có thời gian để cho chúng có thể hình thành hoạt tính đã tạo ra một thế hệ
mới. Hoặc cũng có thể KNO3 là nguồn nitơ dễ sử dụng cho sinh trƣởng của
chủng TN2 nên không kích thích quá trình sinh enzym để cố định nitơ tự do
của chủng TN2. Qua đó nhận thấy rằng, nguồn KNO3 có khả kích thích sinh
0. 9 2. 78 1. 78 1. 95 1. 49 1. 45 9 1. 61 2. 42 1. 62 2. 48 2. 25 1. 6 -65.556 -22.001 21.371 -21.118 8.025 29.856 26.446 6.875 20.889 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 24 48 72 Thời gian (h) N d ễ tiê u (m g/ l) -80.000 -60.000 -40.000 -20.000 0.000 20.000 40.000 % tă ng s o vớ i M TC S Nitơ dễ tiêu (mg/l) MTCS Nitơ dễ tiêu (mg/l) KNO3 Nitơ dễ tiêu (mg/l) (NH4)2SO4 Nitơ dễ tiêu (mg/l) NH4H2PO4 % tăng so với MTCS KNO3 % tăng so với Ashby (NH4)2SO4
% tăng so với Ashby NH4H2PO4
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2
Đối với nguồn nitơ (NH4)2SO4 và nguồn NH4H2PO4 cho khả năng sinh
trƣởng kém hơn so với nguồn KNO3 nhƣng lại cho hoạt tính cố định nitơ cao
hơn. Nguồn (NH4)2SO4 cho khả năng cố định nitơ tốt nhất, hàm lƣợng NH+4
trong dịch nuôi cấy cao nhất đạt 2,78mg/l cao hơn so với môi trƣờng cơ sở
29,8%. Còn đố với nguồn NH4H2PO4 mặc dù cho khả năng sinh trƣởng kém
nhất nhƣng vẫn kích thích quá trình sinh enzym cố định nitơ, hàm lƣợng NH+4
trong dịch nuôi cấy đạt cực đại trong dịch nuôi cấy là 2,48mg/l cao hơn 21,3% so với môi trƣờng cơ sở.
Từ các kết quả trên cho thấy, nguồn nitơ tốt nhất cho sinh trƣởng của
chủng TN2 là KNO3, nhƣng lại không tốt cho quá trình cố định nitơ tự do của
chủng TN2. Các kết quả trên cho thấy, muối (NH4)2SO4 vừa tốt cho sinh
trƣởng đồng thời vừa tốt cho quá trình cố định nitơ của chủng TN2. Vì vậy,
3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3
Nhóm vi khuẩn cố định nitơ là nhóm vi khuẩn thƣờng xuất hiện ở các
loại đất có pH kiềm. CaCO3 là một trong những nhân tố có ảnh hƣởng tới pH
của môi trƣờng. Vì vậy, để tối ƣu hoá thành phần môi trƣờng nuôi cấy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ tới sự sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.8.
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trƣởng của chủng TN2
Kết quả ở hình 3.9 cho thấy nồng độ CaCO3 khác nhau ảnh hƣởng khác
nhau đến quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TN2.
Đối với nồng độ CaCO3 0,4% (nồng độ thấp nhất) thì chủng vi khuẩn
TN2 sinh trƣởng nhanh từ 0 - 24h nhƣng lại giảm nhẹ từ 24 - 72h và mật độ
tối đa chỉ đạt khoảng 108CFU/ml (sau 24h nuôi cấy).
Đối với nồng độ CaCO3 0,6% (nồng độ cao nhất) thì ta cũng thấy vi
khuẩn TN2 sinh trƣởng nhanh từ 0 - 24h nhƣng lại giảm nhẹ từ 24 - 48h và có
tăng nhẹ từ 48 - 72h, nhƣng mật độ tối đa cũng chỉ đạt khoảng < 108
Nguyên nhân có thể là do nồng độ CaCO3 quá cao dẫn đến ức chế khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn TN2.
Đối với nồng độ CaCO3 0,45%; 0,5% và 0,55% thì vi khuẩn TN2 lại
sinh trƣởng nhanh hơn hẳn từ 0 – 24h và sau đó tốc độ sinh trƣởng có chậm lại 24 – 48h nhƣng mật độ tế bào vẫn tăng, mật độ tế bào tối đa đạt tới
109CFU/ml đối với nồng độ 0,45% và 0,55%, riêng với nồng độ 0,5 % mật độ
tế bào tối đa đạt tới >109CFU/ml. Sau 48h nuôi cấy mật độ ở 3 nồng độ này
đều có xu hƣớng giảm, nhƣng mật độ tế bào ở nồng độ 0,5% cao hơn so với
hai nồng độ 0,45% và 0,55%. Vì vậy, nồng độ CaCO3 0,5% là nồng độ thích
hợp nhất cho sinh trƣởng của chủng TN2.
Kết quả đánh giá khả năng cố định nitơ của chủng TN2 đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn CaCO3 đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2
Thời gian nuôi (h)
Hàm lƣợng NH+
4 trong dịch nuôi cấy ở các nồng độ CaCO3,