2.7.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
2.7.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị trên cơ sở môi trƣờng Ashby và nguồn đƣờng đƣợc thay bằng các nguồn sau: glucoza saccharoza, lactoza, manitol. Các môi trƣờng đƣợc phân vào bình 1000ml mỗi bình 200ml và khử trùng ở
1210C trong 30 phút. Sau đó để nguội và cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ
TN2 vào, rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các
thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby với nguồn cacbon là lactoza với các nồng độ 1%; 1,5%; 2%; 2,5% và 3%. Các môi trƣờng đƣợc phân vào các bình
1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Môi
trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc
200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h, 48h và
72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby nguồn cacbon là lactoza 2% và có bổ sung
các nguồn nitơ: KNO3, (NH4)2SO4 và ure với nồng độ 0,1%. Các môi trƣờng
đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210
C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào
rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm:
0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby với 2% lactose; 0,1% (NH4)2SO4 và với
các nồng độ CaCO3: 0,4%; 0,45%; 0,5%; 0,55% và 0,6%. Các môi trƣờng
đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210
C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào
rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm:
0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
2.7.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chuẩn bị môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở các thí nghiệm trên. Môi trƣờng đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và
khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố
định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở các nhiệt độ 250
, 300, 350
và 400C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định
mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2.2 Ảnh hưởng của pH
Chuẩn bị môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở các thí nghiệm trên. Môi trƣờng đƣợc phân vào 6 bình tam giác 1000ml với thể dịch là 200ml sau đó chỉnh pH các bình lần lƣợt về 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 và khử trùng ở
1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ
TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các
thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2.3 Ảnh hưởng của độ cấp khí
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị với các thành phần và pH tối ƣu ở các thí nghiệm trên và đƣợc phân vào các bình tam giác 1000ml với tỷ lệ dịch nhƣ
sau: 1: 10; 2:10; 3:10 và 4:10. Sau đó khử trùng môi trƣờng ở 1210C trong 30
phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi
cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h,
48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.8. Thử nghiệm trên cây trồng trong phòng thí nghiệm
Tiến hành trồng thử nghiệm cây mồng tơi trên đất có tƣới dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
Chuẩn bị 1 bình dịch môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở trên.
Sau đó khử trùng môi trƣờng ở 1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy
chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 300C,
sau 48h thì lấy dịch đó tƣới vào các chậu cát đã chuẩn bị để gieo hạt. Mỗi chậu cho 1 kg cát đã khử trùng. Tiến hành 5 mẫu TN, gồm:
ĐC: không tƣới dịch nuôi cấy TN1: tƣới 5% dịch = 20ml dịch TN2: tƣới 10% dịch = 40ml dịch TN3: tƣới 15% dịch = 60ml dịch
TN4: tƣới 20% dịch = 80ml dịch
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và mỗi chậu đƣợc gieo cấy 10 hạt rau mồng tơi. Trong quá trình chăm sóc thƣơng xuyên cung cấp độ ẩm và ánh sáng đầy đủ cho các chậu, sau 25 ngày thì kết thúc thí nghiệm.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
3.1.1. Một số đặc điểm của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
Dƣới đây là một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do trong bộ sƣu tập giống của Phòng Vi sinh vật môi trƣờng.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
TT Chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng Ashby sau 48h
Đặc điểm hình thái tế bào (24h nuôi cấy trên Ashby)
1 ĐT1 Khuẩn lạc tròn, lồi mặt bóng,
nhầy, trong, đƣờng kính 0,8 – 1 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng nhất và có chuyển động
2 ĐT2 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng
đục, đƣờng kính khuẩn lạc 1 – 1,5 mm
Tế bào hình que dài, đứng đơn lẻ nhiều hơn kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
3 ĐT3 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc,
đƣờng kính khuẩn lạc < 0,8 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
5 ĐT4 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu ngà,
mặt det, quánh, đƣờng kính khuẩn lạc 1,5 – 2,5 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
lồi, quánh, đƣờng kính 1 – 1,5 mm
đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
7 R2 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc nhỏ li
ti, đƣờng kính < 0,5mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động
8 R3 Khuẩn lạc trắng đục, lồi, quánh
đƣờng kính 1,5 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ và kết đôi, có chuyển động
9 R4 Khuẩn lạc tròn, lồi, màu ngà,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động 10 R5 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, đƣờng kính 1 – 2 mm Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ, có chuyển động 11 RN1 Khuẩn lạc màu vàng, mặt bóng nhày, đƣờng kính 2 – 3mm Tế bào hình que ngắn, có chuyển động 12 RN2 Khuẩn lạc màu ngà, mặt bóng, hơi quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
13 RL1 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, nhày,
quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất đồng nhất, có chuyển động
14 RL2 Khuẩn lạc nhỏ li ti trong nhƣ giọt
nƣớc
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
15 TN1 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có
chuyển động
16 TN2 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 2 – 3mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ nhiều hơn kết đôi, có chuyển động
17 TN3 Khuẩn lạc tròn, trong, dẹt, màu
ngà, đƣờng kính 3 – 5 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
18 TN4 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, dẹt,
đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ, có chuyển động
19 TN5 Khuẩn lạc trong, lồi, đƣờng kính
1,5 – 2mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có chuyển động
Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cố định nitơ
3.1.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ cao
Từ 19 chủng vi khuẩn của Phòng đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby để đánh giá khả năng cố định nitơ của chúng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính cố định nitơ của các chủng vi khuẩn
TT Tên chủng Mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy (CFU/ml)
Nồng độ NH4 + trong dịch nuôi cấy (mg/l) 1 ĐT1 7,3x108 0,08 2 ĐT2 6,9x107 0,56 3 ĐT3 2,1x108 0,234 5 ĐT4 1,5x108 0,432 6 R1 4,5x107 0 7 R2 3,2x109 1,02 8 R3 2,4x107 0,83 9 R4 8,8x108 0,677 10 R5 2,2x107 0,142 11 RN1 5,6x109 1,03 12 RN2 5,4x107 0,97 13 RL1 5,1x108 0,845 14 RL2 1,1x107 0,345 15 TN1 6,7x108 1,07 16 TN2 8,6x109 2,44 17 TN3 2,3x108 0,963 18 TN4 3,2x108 0,485 19 TN5 1,4x107 0,113
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, các chủng vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt trên
mật độ đạt tới 109 CFU/ml: R2, RN1 và TN2. Trong 19 chủng đem thử hoạt
tính cố định nitơ chỉ có 4 chủng cho nồng độ NH4
+
trong trong dịch nuôi cấy
> 1mg/l: R2, RN1, TN1, TN2. Còn các chủng còn lại đều có nồng độ NH4
+
thấp hơn 1mg/l. Trong 4 chủng có hoạt tính cố định nitơ cao có chủng TN2 có
hoạt tính cố định nitơ cao nhất nồng độ NH4+ trong dịch nuôi cấy đạt 2,44
mg/l sau 72h nuôi cấy và hơn nữa chủng này lại có khả năng sinh trƣởng tốt. Vì vậy, chủng TN2 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn TN2
Khuẩn lạc màu trắng đục, mặt bóng nhầy, lồi, sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby khuẩn lạc có đƣờng kính 1 – 2mm. Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy trên thạch khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sậm nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh nhuộn gram tế bào của chủng vi khuẩn TN2
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn TN2 TT Thời điểm quan sát (h) Đặc điểm hình thái tế bào Trạng thái di động Gram
1 12 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều.
+++
2 24 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều. +++ Gr- 3 48 - Tế bào hình que, đứng riêng lẻ và kết đôi, tế bào chất không còn đồng đều, xung quanh tế bào xuất hiện bao nhầy
+
4 72 - Tế bào kết đôi nhiều,
tế baò chất bắt đầu xuất hiện các hạt, xung quanh tế bào có bao nhầy
-
Ghi chú: +++: di động mạnh; ++: di động bình thường; +: di động yếu; - : bất động, gram âm
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Dựa vào khóa phân loại của Bergey‟s chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của chủng TN2 và kết quả thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn TN2
Test Kết quả Test Kết quả
Oxidase + Indole +
Catalase + Gelatin hydrolysis -
Ortho nitro phenyl β - D - galactopyranoside
- Acid from glucose +
Sodium citrate + Acid from maltose +
Sodium melonate + Acid from sucrose +
Lysine decarboxylase - Acid from mannose -
Arginine dihydrolase - Acid arabinose -
Ornithine decarboxylase + Acid from rhamnose +
H2S production + Acid from sorbitol +
Urea hydrolysis + Acid from inositol -
Tryptophan deaminase + Acid from adonitol -
Voges - Proskauer - Acid from raffinose +
Ghi chú: +: phản ứng có xảy ra - : phản ứng không xảy ra
Kết quả thử phản ứng sinh hóa của chủng TN2 với 24 test theo khóa phân loại của Bergey‟s cho thấy: có 15 phản ứng dƣơng tính và 9 phản ứng không xảy ra. Chủng vi khuẩn TN2 có khả năng lên men 6/10 nguồn đƣờng tạo axit, sinh indole, thủy phân ure, tọa enzym phân hủy tryptophan, sinh khí
H2S. Và khi so sánh với khóa phân loại của Bergey‟s cho thấy chủng vi khuẩn
Hình 3.3. Một số hình ảnh về phản ứng sinh hóa của chủng TN2
3.2. Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy kiện nuôi cấy
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rất nhiều đối với quá trình sinh trƣởng và hình thành các sản phẩm của vi sinh vật. Thành phần dinh dƣỡng quá cao hay quá thấp cũng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và hình thành sản phẩm của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 là cần thiết.
3.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon
Cacbon là nguồn vật chất cung cấp cho quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt quá trình biến hoá phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Cacbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lƣợng khô của tế bào. Trong quá trình sinh hóa nguồn cacbon còn sinh ra năng lƣợng cần thiết cho quá
trình hoạt động của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn
cacbon duy nhất hay chủ yếu để sinh trƣởng, khi đó nguồn cacbon không phải là nguồn sinh năng lƣợng.
Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn cacbon. Đƣờng nói chung là nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng tốt cho vi sinh vật. Nhƣng tuỳ từng loại đƣờng mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ
trong môi trƣờng chứa glucoza và galactoza thì vi khuẩn Escherichia coli sử
dụng trƣớc glucoza (gọi là nguồn Cacbon tốc hiệu) còn galactoza đƣợc sử dụng sau (gọi là nguồn cacbon trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp ngƣời ta sử dụng nguồn cacbon chủ yếu là glucoza, saccharoza, rỉ đƣờng (phụ phẩm của nhà máy đƣờng) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn xenluloza tự nhiên hay dịch thuỷ phân xenluloza. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên sinh trƣởng của chủng TN2 Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, trên cả 4 nguồn cacbon sử dụng để nghiên cứu chủng vi khuẩn TN2 đều sinh trƣởng tốt. Sự sinh trƣởng của chủng vi khuẩn này đều tuân theo quy luật nhƣ sau: chủng TN2 sinh trƣởng mạnh trong khoảng từ 0 – 24h (mật độ ở tất cả các nguồn cacbon đều đạt khoảng
109CFU/ml). Từ 24 – 48h tốc độ sinh trƣởng của chủng TN2 bắt đầu giảm
dần và mật độ cực đại đạt đƣợc ở 48h (dao động trong khoảng từ 109 –
1010CFU/ml). Sau 48h mật độ ở tất cả các phƣơng án thí nghiệm đều có xu
hƣớng giảm hoặc đi vào giai đoạn ổn định. Qua đó cho thấy, nguồn cacbon không có ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TN2.
Bên cạnh khả năng sinh trƣởng để đánh giá ảnh hƣởng của nguồn cacbon cần phải đánh giá thông qua khả năng cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2 Thời gian nuôi cấy (h) Hàm lƣợng NH+
4 trong dịchnuôi cấy, (mg/l)
ĐC Glucoza Sacaroza Lactoza Manitol
24 0 0,22 0,6 1,5 0,99
48 0 0,32 0,99 1,92 1,5
72 0 0,55 1,12 1,23 1,11
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy ở các
phƣơng án thí nghiệm có sự biến động khác nhau.
Đối với nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hàm lƣợng NH+
4 tăng từ 24