Tiến hành trồng thử nghiệm cây mồng tơi trên đất có tƣới dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
Chuẩn bị 1 bình dịch môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở trên.
Sau đó khử trùng môi trƣờng ở 1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy
chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 300C,
sau 48h thì lấy dịch đó tƣới vào các chậu cát đã chuẩn bị để gieo hạt. Mỗi chậu cho 1 kg cát đã khử trùng. Tiến hành 5 mẫu TN, gồm:
ĐC: không tƣới dịch nuôi cấy TN1: tƣới 5% dịch = 20ml dịch TN2: tƣới 10% dịch = 40ml dịch TN3: tƣới 15% dịch = 60ml dịch
TN4: tƣới 20% dịch = 80ml dịch
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và mỗi chậu đƣợc gieo cấy 10 hạt rau mồng tơi. Trong quá trình chăm sóc thƣơng xuyên cung cấp độ ẩm và ánh sáng đầy đủ cho các chậu, sau 25 ngày thì kết thúc thí nghiệm.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
3.1.1. Một số đặc điểm của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
Dƣới đây là một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do trong bộ sƣu tập giống của Phòng Vi sinh vật môi trƣờng.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
TT Chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng Ashby sau 48h
Đặc điểm hình thái tế bào (24h nuôi cấy trên Ashby)
1 ĐT1 Khuẩn lạc tròn, lồi mặt bóng,
nhầy, trong, đƣờng kính 0,8 – 1 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng nhất và có chuyển động
2 ĐT2 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng
đục, đƣờng kính khuẩn lạc 1 – 1,5 mm
Tế bào hình que dài, đứng đơn lẻ nhiều hơn kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
3 ĐT3 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc,
đƣờng kính khuẩn lạc < 0,8 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
5 ĐT4 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu ngà,
mặt det, quánh, đƣờng kính khuẩn lạc 1,5 – 2,5 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
lồi, quánh, đƣờng kính 1 – 1,5 mm
đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
7 R2 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc nhỏ li
ti, đƣờng kính < 0,5mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động
8 R3 Khuẩn lạc trắng đục, lồi, quánh
đƣờng kính 1,5 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ và kết đôi, có chuyển động
9 R4 Khuẩn lạc tròn, lồi, màu ngà,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động 10 R5 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, đƣờng kính 1 – 2 mm Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ, có chuyển động 11 RN1 Khuẩn lạc màu vàng, mặt bóng nhày, đƣờng kính 2 – 3mm Tế bào hình que ngắn, có chuyển động 12 RN2 Khuẩn lạc màu ngà, mặt bóng, hơi quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
13 RL1 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, nhày,
quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất đồng nhất, có chuyển động
14 RL2 Khuẩn lạc nhỏ li ti trong nhƣ giọt
nƣớc
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
15 TN1 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có
chuyển động
16 TN2 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 2 – 3mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ nhiều hơn kết đôi, có chuyển động
17 TN3 Khuẩn lạc tròn, trong, dẹt, màu
ngà, đƣờng kính 3 – 5 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
18 TN4 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, dẹt,
đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ, có chuyển động
19 TN5 Khuẩn lạc trong, lồi, đƣờng kính
1,5 – 2mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có chuyển động
Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cố định nitơ
3.1.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ cao
Từ 19 chủng vi khuẩn của Phòng đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby để đánh giá khả năng cố định nitơ của chúng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính cố định nitơ của các chủng vi khuẩn
TT Tên chủng Mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy (CFU/ml)
Nồng độ NH4 + trong dịch nuôi cấy (mg/l) 1 ĐT1 7,3x108 0,08 2 ĐT2 6,9x107 0,56 3 ĐT3 2,1x108 0,234 5 ĐT4 1,5x108 0,432 6 R1 4,5x107 0 7 R2 3,2x109 1,02 8 R3 2,4x107 0,83 9 R4 8,8x108 0,677 10 R5 2,2x107 0,142 11 RN1 5,6x109 1,03 12 RN2 5,4x107 0,97 13 RL1 5,1x108 0,845 14 RL2 1,1x107 0,345 15 TN1 6,7x108 1,07 16 TN2 8,6x109 2,44 17 TN3 2,3x108 0,963 18 TN4 3,2x108 0,485 19 TN5 1,4x107 0,113
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, các chủng vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt trên
mật độ đạt tới 109 CFU/ml: R2, RN1 và TN2. Trong 19 chủng đem thử hoạt
tính cố định nitơ chỉ có 4 chủng cho nồng độ NH4
+
trong trong dịch nuôi cấy
> 1mg/l: R2, RN1, TN1, TN2. Còn các chủng còn lại đều có nồng độ NH4
+
thấp hơn 1mg/l. Trong 4 chủng có hoạt tính cố định nitơ cao có chủng TN2 có
hoạt tính cố định nitơ cao nhất nồng độ NH4+ trong dịch nuôi cấy đạt 2,44
mg/l sau 72h nuôi cấy và hơn nữa chủng này lại có khả năng sinh trƣởng tốt. Vì vậy, chủng TN2 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn TN2
Khuẩn lạc màu trắng đục, mặt bóng nhầy, lồi, sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby khuẩn lạc có đƣờng kính 1 – 2mm. Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy trên thạch khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sậm nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh nhuộn gram tế bào của chủng vi khuẩn TN2
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn TN2 TT Thời điểm quan sát (h) Đặc điểm hình thái tế bào Trạng thái di động Gram
1 12 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều.
+++
2 24 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều. +++ Gr- 3 48 - Tế bào hình que, đứng riêng lẻ và kết đôi, tế bào chất không còn đồng đều, xung quanh tế bào xuất hiện bao nhầy
+
4 72 - Tế bào kết đôi nhiều,
tế baò chất bắt đầu xuất hiện các hạt, xung quanh tế bào có bao nhầy
-
Ghi chú: +++: di động mạnh; ++: di động bình thường; +: di động yếu; - : bất động, gram âm
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Dựa vào khóa phân loại của Bergey‟s chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của chủng TN2 và kết quả thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn TN2
Test Kết quả Test Kết quả
Oxidase + Indole +
Catalase + Gelatin hydrolysis -
Ortho nitro phenyl β - D - galactopyranoside
- Acid from glucose +
Sodium citrate + Acid from maltose +
Sodium melonate + Acid from sucrose +
Lysine decarboxylase - Acid from mannose -
Arginine dihydrolase - Acid arabinose -
Ornithine decarboxylase + Acid from rhamnose +
H2S production + Acid from sorbitol +
Urea hydrolysis + Acid from inositol -
Tryptophan deaminase + Acid from adonitol -
Voges - Proskauer - Acid from raffinose +
Ghi chú: +: phản ứng có xảy ra - : phản ứng không xảy ra
Kết quả thử phản ứng sinh hóa của chủng TN2 với 24 test theo khóa phân loại của Bergey‟s cho thấy: có 15 phản ứng dƣơng tính và 9 phản ứng không xảy ra. Chủng vi khuẩn TN2 có khả năng lên men 6/10 nguồn đƣờng tạo axit, sinh indole, thủy phân ure, tọa enzym phân hủy tryptophan, sinh khí
H2S. Và khi so sánh với khóa phân loại của Bergey‟s cho thấy chủng vi khuẩn
Hình 3.3. Một số hình ảnh về phản ứng sinh hóa của chủng TN2
3.2. Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy kiện nuôi cấy
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rất nhiều đối với quá trình sinh trƣởng và hình thành các sản phẩm của vi sinh vật. Thành phần dinh dƣỡng quá cao hay quá thấp cũng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và hình thành sản phẩm của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 là cần thiết.
3.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon
Cacbon là nguồn vật chất cung cấp cho quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt quá trình biến hoá phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Cacbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lƣợng khô của tế bào. Trong quá trình sinh hóa nguồn cacbon còn sinh ra năng lƣợng cần thiết cho quá
trình hoạt động của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn
cacbon duy nhất hay chủ yếu để sinh trƣởng, khi đó nguồn cacbon không phải là nguồn sinh năng lƣợng.
Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn cacbon. Đƣờng nói chung là nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng tốt cho vi sinh vật. Nhƣng tuỳ từng loại đƣờng mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ
trong môi trƣờng chứa glucoza và galactoza thì vi khuẩn Escherichia coli sử
dụng trƣớc glucoza (gọi là nguồn Cacbon tốc hiệu) còn galactoza đƣợc sử dụng sau (gọi là nguồn cacbon trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp ngƣời ta sử dụng nguồn cacbon chủ yếu là glucoza, saccharoza, rỉ đƣờng (phụ phẩm của nhà máy đƣờng) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn xenluloza tự nhiên hay dịch thuỷ phân xenluloza. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên sinh trƣởng của chủng TN2 Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, trên cả 4 nguồn cacbon sử dụng để nghiên cứu chủng vi khuẩn TN2 đều sinh trƣởng tốt. Sự sinh trƣởng của chủng vi khuẩn này đều tuân theo quy luật nhƣ sau: chủng TN2 sinh trƣởng mạnh trong khoảng từ 0 – 24h (mật độ ở tất cả các nguồn cacbon đều đạt khoảng
109CFU/ml). Từ 24 – 48h tốc độ sinh trƣởng của chủng TN2 bắt đầu giảm
dần và mật độ cực đại đạt đƣợc ở 48h (dao động trong khoảng từ 109 –
1010CFU/ml). Sau 48h mật độ ở tất cả các phƣơng án thí nghiệm đều có xu
hƣớng giảm hoặc đi vào giai đoạn ổn định. Qua đó cho thấy, nguồn cacbon không có ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TN2.
Bên cạnh khả năng sinh trƣởng để đánh giá ảnh hƣởng của nguồn cacbon cần phải đánh giá thông qua khả năng cố định nitơ của chủng vi khuẩn TN2 đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2 Thời gian nuôi cấy (h) Hàm lƣợng NH+
4 trong dịchnuôi cấy, (mg/l)
ĐC Glucoza Sacaroza Lactoza Manitol
24 0 0,22 0,6 1,5 0,99
48 0 0,32 0,99 1,92 1,5
72 0 0,55 1,12 1,23 1,11
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy ở các
phƣơng án thí nghiệm có sự biến động khác nhau.
Đối với nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hàm lƣợng NH+
4 tăng từ 24
– 72h và đều cao hơn so với ĐC. Hàm lƣợng NH+
4 đạt cực đại đạt 0,55mg/l
đối với glucoza và 1,12mg/l đối với sacaroza.
Với nguồn lactoza và manitol hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy tăng
từ 24 – 48 h và giảm 48 – 72h. Hàm lƣợng NH+4 trong dịchnuôi cấy cực đại
đạt là 1,92mg/l đối với lactoza và 1,5mg/l đối với manitol.
Tại sao hàm lƣợng NH+4 trong dịch nuôi cấy trên 2 nguồn lactoza,
manitol giảm trong khoảng 48 – 72h còn trên 2 nguồn glucoza và sacaroza vẫn tăng trong giai đoạn này. Điều này có thể lý giải nhƣ sau: đối với nguồn cacbon lactoza và manitol trong giai đoạn 48 – 72 h mật độ tế bào có xu hƣớng giảm mạnh hơn so với nguồn glucoza và sacaroza dẫn đến giảm tốc độ cố định nitơ. Hơn nữa sau 48h nguồn dinh dƣỡng trong dịch nuôi cấy đã giảm có thể làm ức chế khả năng cố định nitơ của vi khuẩn và hơn nữa khi nguồn dinh dƣỡng của môi trƣờng đã giảm các vi sinh vật có xu hƣớng sử dụng các
sản phẩm do mình tạo ra để duy trì sự sống. Vì vậy, dẫn đến hàm lƣợng NH+4
ở 2 nguồn lactoza và manitol tại 72h giảm so với 48h khoảng 26 – 35,9%. Còn đối với nguồn glucoza và sacaroza trong giai đoạn từ 48h – 72h mật độ có xu hƣớng ổn định và hơi tăng. Do mật độ vẫn đƣợc duy trì nên hoạt tính cố định nitơ không giảm mà còn tăng. Tuy nhiên, khi so sánh hoạt tính cố định nitơ trên nguồn lactoza và manitol vẫn cao hơn so với nguồn glucoza và sacaroza. Điều này cho thấy nguồn lactoza và nguồn manitol vừa có khả năng kích thích sinh trƣởng vừa có khả năng kích thích hoạt tính cố định nitơ của chủng TN2. Khi so sánh hoạt tính cố định nitơ trên 4 nguồn cacbon cho thấy, nguồn lactoza cho hoạt tính cố định nitơ cao nhất (đạt 1,92mg/l) cao hơn so với nguồn manitol 21,8%, nguồn sacaroza 41,6%, nguồn glucoza 71,4%. Vì vậy, sẽ lựa chọn nguồn lactoza làm nguồn đƣờng thích hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo của chủng vi khuẩn TN2.
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon
Để tối ƣu hóa cho quá trình nhân giống phục vụ sản xuất, bên cạnh lựa chọn nguồn đƣờng hay nguồn cacbon chúng ta cần quan tâm đến ảnh hƣởng của nồng độ. Sau đây là kết quả nghiên ảnh hƣởng của nồng độ lactoza lên khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt tính của chủng vi khuẩn TN2.
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, ở mỗi nồng độ lactoza khác nhau chủng TN2 có quy luật sinh trƣởng khác nhau.
Với nồng độ lactoza 1%, chủng TN2 sinh trƣởng nhanh từ 0 – 24h, từ 24 – 48h gần nhƣ ổn định không có sự biến động nhiều về mật độ và sau 48h mật độ có xu hƣớng giảm. Điều này có thể giải thích nhƣ sau, ở nồng 1% lactoza nguồn dinh dƣỡng cacbon thấp, nên trong khảng thời gian từ 24-48h tốc độ sinh trƣởng chậm lại, sau 48h mật độ giảm mạnh do nguồn dinh dƣỡng cacbon trong môi trƣờng đã cạn kiệt.
Với nồng độ lactoza từ 1,5 – 2,5%: Chủng TN2 sinh trƣởng nhanh trong giai đoạn 0 – 24h, từ 24 – 48h tốc độ sinh trƣởng đã giảm nhƣng mật độ tế bào vẫn cao hơn so với nồng độ lactoza 1%, từ 48 – 72h mật độ tế bào giảm (pha suy vong).
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ lactoza lên sinh trƣởng của chủng TN2 Ở nồng độ 3% lactoza (nồng độ cacbon cao nhất), mật độ vi khuẩn có xu hƣớng tăng theo thời gian từ 0 – 72h, nhƣng mật độ tại các thời điểm 24h và 48h vẫn thấp hơn so với ở nồng độ 1,5 – 2,5%. Điều này có thể lý giải nhƣ sau, trong giai đoạn 0 – 48h do nồng độ lactoza trong môi trƣờng nuôi cấy quá cao dẫn đến ức chế khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn TN2. Theo thời gian nuôi cấy nồng độ lactoza trong môi trƣờng giảm dần, nhƣng nguồn cacbon còn lại vẫn đảm bảo đủ cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn. Do đó, dù sau 48h mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn lactoza 3% vẫn tăng. Nhƣng mật độ vi khuẩn của thí nghiệm này vẫn thấp hơn so với