2.6.1 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật
- Phƣơng pháp pha loãng: lấy 1ml dịch mẫu cho vào cho vào ống
nghiệm đựng 9ml dịch nƣớc pha loãng đƣợc nồng độ 10-1 lắc đều ống
nghiệm. Sau đó cho 1ml ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml dịch nƣớc pha loãng
đƣợc nồng độ 10-2
lắc đều ống nghiệm. Tiếp tục hút 1ml ở nồng độ 10-2 cho
vào ống nghiệm tiếp theo đƣợc nồng độ pha loãng 10-3. Tiến hành tƣơng tự
nhƣ vậy với các nồng độ pha loãng tiếp theo.
- Chuẩn bị môi trƣờng: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy đƣợc chuẩn bị là môi trƣờng Ashby. Từ nồng độ pha loãng thích hợp, nhỏ 0,1ml dịch pha
loãng vào môi trƣờng thạch. Tiến hành trang đều mẫu và đƣợc ủ ở 300
C trong 24h để cho khuẩn lạc phát triển hoàn thiện. Số lƣợng tế bào đƣợc ƣớc lƣợng thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch, mỗi nồng độ pha loãng đƣợc lặp lại 3 đĩa. Số khuẩn lạc trên đĩa thạch dao động 30-300 khuẩn lạc. Kết quả chỉ ra rằng số khuẩn lạc hình thành trên ml( CFU/ml)
Công thức xác định số lƣợng tế bào X = a.b.10 (CFU/ml)
a: số lƣợng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri b: nghịch đảo của nồng độ pha loãng
2.6.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý
2.6.2.1. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép
Nhỏ một giọt nƣớc vô trùng lên phiến kính (lame) thêm vào đó một ít sinh khối tế bào vi sinh vật. Dùng que cấy di đều để sinh khối hòa dều trong giọt nƣớc sau đó đạy lên trên bằng một lá kính mỏng gọi là lamelle.
Tiêu bản giọt ép dung để quan sát hình thái tế bào.
2.6.2.2. Phương pháp nhuộn gram
- Dùng pipet nhỏ một giọt nƣớc vô trùng lên lam kính
- Nhỏ một giọt mẫu chủng giống, hòa đều vào giọt nƣớc, dàn đều ra phần giữa lam kính.
- Sử dụng panh kẹp lam kính và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu.
- Dùng pipet nhỏ một giọt tím kết tinh và gạt đều lên phần mẫu đã cố định, để trong 3 phút sau đó rửa lại bằng nƣớc sạch rồi hơ qua đèn cồn cho khô mẫu.
- Dùng pipet nhỏ một giọt Lugol, gạt đều, để một phút, rửa, hơ khô. - Cuối cùng, dùng pipet nhỏ một giọt Fucshin lên gạt đều, để một phút, rửa, hơ khô và soi dƣới vật kính dầu.
- Nếu vi khuẩn có gram dƣơng thì tế bào dƣới kính hiển vi bắt mầu tím, còn nếu là gram âm tế bào bắt màu hồng.
2.6.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa
2.6.4. Phương pháp chuẩn bị chủng giống
Lấy một vòng que cấy sinh khối vi khuẩn cố định nitơ tự do trên đĩa thạch Ashby cấy vào bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trƣờng Ashby
dịch thể, sau đó đƣợc nuôi cấy trên máy lắc 200vòng/ phút ở 300C trong 24h
để làm chủng giống cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.6.5 Phương pháp xác định nitơ dễ tiêu
*Chưng cất mẫu
- Chuẩn bị dung dịch Borat: 44ml NaOH 0,1N + 250ml Na2B4O7 0,025M, lắc
đều sau đó đƣợc định mức bằng nƣớc cất cho đến 500ml.
- Thao tác
+ Bình tam giác 250ml (bình hấp phụ): cho 50ml H2SO4 0,04N
+Bình cầu: 15ml dịch nuôi cấy + 285ml nƣớc cất (pha loãng 20 lần) + 25ml dung dịch Borat. Lắc đều và điều chỉnh cho pH trong khoảng 9 – 9,5.
+ Lắp bình tam giác và bình cầu vào hệ thống cất và chạy hệ thống cất. Dừng cất khi lƣợng dịch trong bình hấp phụ đạt 200ml.
*Phương pháp so màu bằng máy UV
- Chuẩn bị thuốc thử: 5g phenol + 0,025g nitrobroxitrodium + 500ml nƣớc cất (dung dịch dùng trong ngày)
- Chuẩn bị dung dịch Hypocloride: 3g NaOH + 10ml NaOCl 0,1% + 200ml nƣớc cất.
- Tiến hành: lấy 5ml lít mẫu đã cất ở trên + 3ml hypocloride lắc đều, sau đó
thêm 3ml thuốc thử lắc đều. Rồi để yên ở 400C trong khoảng 30 – 40 phút rồi
2.7 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.7.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
2.7.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị trên cơ sở môi trƣờng Ashby và nguồn đƣờng đƣợc thay bằng các nguồn sau: glucoza saccharoza, lactoza, manitol. Các môi trƣờng đƣợc phân vào bình 1000ml mỗi bình 200ml và khử trùng ở
1210C trong 30 phút. Sau đó để nguội và cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ
TN2 vào, rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các
thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby với nguồn cacbon là lactoza với các nồng độ 1%; 1,5%; 2%; 2,5% và 3%. Các môi trƣờng đƣợc phân vào các bình
1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Môi
trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc
200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h, 48h và
72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby nguồn cacbon là lactoza 2% và có bổ sung
các nguồn nitơ: KNO3, (NH4)2SO4 và ure với nồng độ 0,1%. Các môi trƣờng
đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210
C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào
rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm:
0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3
Chuẩn bị môi trƣờng Ashby với 2% lactose; 0,1% (NH4)2SO4 và với
các nồng độ CaCO3: 0,4%; 0,45%; 0,5%; 0,55% và 0,6%. Các môi trƣờng
đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và khử trùng ở 1210
C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào
rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm:
0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
2.7.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chuẩn bị môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở các thí nghiệm trên. Môi trƣờng đƣợc phân vào các bình 1000ml với thể dịch là 200ml và
khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố
định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở các nhiệt độ 250
, 300, 350
và 400C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định
mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2.2 Ảnh hưởng của pH
Chuẩn bị môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở các thí nghiệm trên. Môi trƣờng đƣợc phân vào 6 bình tam giác 1000ml với thể dịch là 200ml sau đó chỉnh pH các bình lần lƣợt về 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 và khử trùng ở
1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ
TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các
thời điểm: 0h, 24h, 48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.7.2.3 Ảnh hưởng của độ cấp khí
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị với các thành phần và pH tối ƣu ở các thí nghiệm trên và đƣợc phân vào các bình tam giác 1000ml với tỷ lệ dịch nhƣ
sau: 1: 10; 2:10; 3:10 và 4:10. Sau đó khử trùng môi trƣờng ở 1210C trong 30
phút. Môi trƣờng để nguội cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi
cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C. Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm: 0h, 24h,
48h và 72h để xác định mật độ tế bào và hàm lƣợng nitơ dễ tiêu trong dịch nuôi cấy.
2.8. Thử nghiệm trên cây trồng trong phòng thí nghiệm
Tiến hành trồng thử nghiệm cây mồng tơi trên đất có tƣới dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
Chuẩn bị 1 bình dịch môi trƣờng với các thành phần đã tối ƣu ở trên.
Sau đó khử trùng môi trƣờng ở 1210C trong 30 phút. Môi trƣờng để nguội cấy
chủng vi khuẩn cố định nitơ TN2 vào rồi nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 300C,
sau 48h thì lấy dịch đó tƣới vào các chậu cát đã chuẩn bị để gieo hạt. Mỗi chậu cho 1 kg cát đã khử trùng. Tiến hành 5 mẫu TN, gồm:
ĐC: không tƣới dịch nuôi cấy TN1: tƣới 5% dịch = 20ml dịch TN2: tƣới 10% dịch = 40ml dịch TN3: tƣới 15% dịch = 60ml dịch
TN4: tƣới 20% dịch = 80ml dịch
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và mỗi chậu đƣợc gieo cấy 10 hạt rau mồng tơi. Trong quá trình chăm sóc thƣơng xuyên cung cấp độ ẩm và ánh sáng đầy đủ cho các chậu, sau 25 ngày thì kết thúc thí nghiệm.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
3.1.1. Một số đặc điểm của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
Dƣới đây là một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do trong bộ sƣu tập giống của Phòng Vi sinh vật môi trƣờng.
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do
TT Chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng Ashby sau 48h
Đặc điểm hình thái tế bào (24h nuôi cấy trên Ashby)
1 ĐT1 Khuẩn lạc tròn, lồi mặt bóng,
nhầy, trong, đƣờng kính 0,8 – 1 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng nhất và có chuyển động
2 ĐT2 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng
đục, đƣờng kính khuẩn lạc 1 – 1,5 mm
Tế bào hình que dài, đứng đơn lẻ nhiều hơn kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
3 ĐT3 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc,
đƣờng kính khuẩn lạc < 0,8 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
5 ĐT4 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu ngà,
mặt det, quánh, đƣờng kính khuẩn lạc 1,5 – 2,5 mm
Tế bào hình que, đứng đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
lồi, quánh, đƣờng kính 1 – 1,5 mm
đơn lẻ hoặc kết đôi, có chuyển động
7 R2 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc nhỏ li
ti, đƣờng kính < 0,5mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động
8 R3 Khuẩn lạc trắng đục, lồi, quánh
đƣờng kính 1,5 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ và kết đôi, có chuyển động
9 R4 Khuẩn lạc tròn, lồi, màu ngà,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que, đứng riêng lẻ ít kết đôi, có chuyển động 10 R5 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, đƣờng kính 1 – 2 mm Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ, có chuyển động 11 RN1 Khuẩn lạc màu vàng, mặt bóng nhày, đƣờng kính 2 – 3mm Tế bào hình que ngắn, có chuyển động 12 RN2 Khuẩn lạc màu ngà, mặt bóng, hơi quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất tƣơng đối đồng đều, có chuyển động
13 RL1 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, nhày,
quánh, đƣờng kính 2 – 3 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, tế bào chất đồng nhất, có chuyển động
14 RL2 Khuẩn lạc nhỏ li ti trong nhƣ giọt
nƣớc
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
15 TN1 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có
chuyển động
16 TN2 Khuẩn lạc tròn, nhày, màu trắng,
quánh, đƣờng kính 2 – 3mm
Tế bào hình que dài, đứng riêng rẽ nhiều hơn kết đôi, có chuyển động
17 TN3 Khuẩn lạc tròn, trong, dẹt, màu
ngà, đƣờng kính 3 – 5 mm
Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, có chuyển động
18 TN4 Khuẩn lạc trong nhƣ nƣớc, dẹt,
đƣờng kính 1 – 2 mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ, có chuyển động
19 TN5 Khuẩn lạc trong, lồi, đƣờng kính
1,5 – 2mm
Tế bào hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc kết đôi, có chuyển động
Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cố định nitơ
3.1.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ cao
Từ 19 chủng vi khuẩn của Phòng đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby để đánh giá khả năng cố định nitơ của chúng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính cố định nitơ của các chủng vi khuẩn
TT Tên chủng Mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy (CFU/ml)
Nồng độ NH4 + trong dịch nuôi cấy (mg/l) 1 ĐT1 7,3x108 0,08 2 ĐT2 6,9x107 0,56 3 ĐT3 2,1x108 0,234 5 ĐT4 1,5x108 0,432 6 R1 4,5x107 0 7 R2 3,2x109 1,02 8 R3 2,4x107 0,83 9 R4 8,8x108 0,677 10 R5 2,2x107 0,142 11 RN1 5,6x109 1,03 12 RN2 5,4x107 0,97 13 RL1 5,1x108 0,845 14 RL2 1,1x107 0,345 15 TN1 6,7x108 1,07 16 TN2 8,6x109 2,44 17 TN3 2,3x108 0,963 18 TN4 3,2x108 0,485 19 TN5 1,4x107 0,113
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, các chủng vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt trên
mật độ đạt tới 109 CFU/ml: R2, RN1 và TN2. Trong 19 chủng đem thử hoạt
tính cố định nitơ chỉ có 4 chủng cho nồng độ NH4
+
trong trong dịch nuôi cấy
> 1mg/l: R2, RN1, TN1, TN2. Còn các chủng còn lại đều có nồng độ NH4
+
thấp hơn 1mg/l. Trong 4 chủng có hoạt tính cố định nitơ cao có chủng TN2 có
hoạt tính cố định nitơ cao nhất nồng độ NH4+ trong dịch nuôi cấy đạt 2,44
mg/l sau 72h nuôi cấy và hơn nữa chủng này lại có khả năng sinh trƣởng tốt. Vì vậy, chủng TN2 đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn TN2
Khuẩn lạc màu trắng đục, mặt bóng nhầy, lồi, sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng Ashby khuẩn lạc có đƣờng kính 1 – 2mm. Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy trên thạch khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sậm nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh nhuộn gram tế bào của chủng vi khuẩn TN2
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn TN2 TT Thời điểm quan sát (h) Đặc điểm hình thái tế bào Trạng thái di động Gram
1 12 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều.
+++
2 24 - Tế bào hình que dài,
đầu tròn, đứng riêng lẻ, tế bào chất tƣơng đối đồng đều. +++ Gr- 3 48 - Tế bào hình que, đứng riêng lẻ và kết đôi, tế bào chất không còn đồng đều, xung quanh tế bào xuất hiện bao nhầy
+
4 72 - Tế bào kết đôi nhiều,
tế baò chất bắt đầu xuất hiện các hạt, xung quanh tế bào có bao nhầy
-
Ghi chú: +++: di động mạnh; ++: di động bình thường; +: di động yếu; - : bất động, gram âm
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Dựa vào khóa phân loại của Bergey‟s chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của chủng TN2 và kết quả thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn TN2
Test Kết quả Test Kết quả
Oxidase + Indole +
Catalase + Gelatin hydrolysis -
Ortho nitro phenyl β - D - galactopyranoside
- Acid from glucose +
Sodium citrate + Acid from maltose +
Sodium melonate + Acid from sucrose +
Lysine decarboxylase - Acid from mannose -
Arginine dihydrolase - Acid arabinose -
Ornithine decarboxylase + Acid from rhamnose +
H2S production + Acid from sorbitol +
Urea hydrolysis + Acid from inositol -
Tryptophan deaminase + Acid from adonitol -
Voges - Proskauer - Acid from raffinose +