+ Cỏc bệnh nhõn cú loột sinh dục khụng do cỏc bệnh LTQĐTD: dịứng thuốc, do cỏc bệnh da bọng nước tự miễn, do ung thư đó xỏc định trờn lõm sàng (xem mục 1.1.4).
+ Bệnh nhõn khụng đồng ý tham gia nghiờn cứụ
2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIấN CỨU 2.2.1 Húa chất, sinh phẩm, dụng cụ 2.2.1 Húa chất, sinh phẩm, dụng cụ
- Cồn tuyệt đối, thuốc nhuộm Giemsạ - Bộ sinh phẩm SFD-HIV của hóng Biorad.
- Bộ sinh phẩm RPR – nosticon II của hóng Biomerieux. - Bộ tỏch chiết ADN của Qiagien.
- Phản ứng PCR: Taq polymerrase 5 đơn vị/1àl, DNTP 2,5 mM, 10X Buffer, MgCl2, nước khử ion.
- Điện di: Ethidium bromide, loading buffer, TBE buffer, 100bp marker, thạch.
2.2.2 Trang thiết bị
- Mỏy lắc trũn, mỏy rung, kớnh hiển vị
- Bể ủ nhiệt, mỏy trộn Vortex, mỏy ly tõm lạnh, mỏy ly tõm ngắn. - Mỏy luõn nhiệt PCR, mỏy điện di, cõn điện tử, lũ vi súng.
- Mỏy soi chụp ảnh gel, tủ lạnh sõu – 400C, pipette man cỏc loạị
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1Thiết kế nghiờn cứu: tiến cứu, mụ tả cắt ngang
2.3.2 Cỡ mẫu
Cỡ mẫu cho nghiờn cứu cắt ngang ước lượng tỷ lệ:
22 2 ) 2 1 ( ) 1 ( Δ − = Z − p p n α Trong đú: n = cỡ mẫu α = mức ý nghĩa thống kờ, lấy giỏ trị 0,05 ) 2 1 ( −α Z = 1,96 tương ứng với giỏ trịα đó chọn là 0,05
Δ = khoảng sai lệch mong muốn giữa tỷ lệ thu được và tỷ lệ quần thể, lấy giỏ trị 0,06
p = tỷ lệ loột sinh dục lấy theo Lo Kuen-Kong là 0.06
Theo cụng thức tớnh trờn, cỡ mẫu cho loột sinh dục tối thiểu của nghiờn cứu là n = 60.
2.3.3 Cỏc bước tiến hành
Bệnh nhõn cú loột sinh dục đến khỏm tại bệnh viện Da Liễu Trung Ương từ thỏng 1-10/2010 được thực hiện theo cỏc bước sau:
- Phỏng vấn để thu thập thụng tin cỏ nhõn, tiền sử, bệnh sử...
- Khỏm lõm sàng để phỏt hiện triệu chứng bệnh và định hướng nguyờn nhõn gõy loột sinh dục.
- Làm một số xột nghiệm tỡm nguyờn nhõn gõy loột: tế bào Tzanck, PCR chẩn đoỏn HSV, xột nghiệm phỏt hiện bệnh giang mai RPR và HIV.
- Những bệnh nhõn cú kết quả xột nghiệm PCR dương tớnh với HSV sẽ được xỏc định tỉ lệ nhiễm và định tớp virus gõy bệnh đồng thời nghiờn cứu đặc
điểm lõm sàng và yếu tố liờn quan.
2.3.3.1 Xỏc định tỷ lệ và định tớp HSV
- Xỏc định tỷ lệ loột sinh dục do herpes simplex/bệnh nhõn đến khỏm cựng thời điểm.
- Xỏc định tỷ lệ loột sinh dục do herpes/cỏc bệnh nhõn loột sinh dục do cỏc NTLTQDTD.
- Định týp HSV gõy bệnh bằng kĩ thuật PCR: tớp virus thường gặp, tớp virus theo giới, theo tiến triển bệnh
2.3.3.2 Nghiờn cứu đặc điểm lõm sàng và cỏc yếu tố liờn quan
- Phỏng vấn bệnh nhõn để thu thập thụng tin
+ Cỏc thụng tin cỏ nhõn: tờn, tuổi, giới, địa chỉ, trỡnh độ học vấn (mự chữ, PTCS, PTTH, đại học, sau đại học), nghề nghiệp (nụng dõn, cụng nhõn HS- SV, CBVC, khụng nghề..), tỡnh trạng hụn nhõn (độc thõn, ly hụn/ly thõn, kết hụn) thời gian mắc bệnh, nguồn lõy (bạn tỡnh, vợ/chồng, mại dõm, khụng xỏc
định)…
+ Cỏc yếu tố liờn quan: tiền sử quan hệ tỡnh dục, số lượng bạn tỡnh, tỡnh trạng sử dụng bao cao sụ..
- Khỏm bệnh để phỏt hiện triệu chứng:
+ Cơ năng: Đau rỏt, bỏng rỏt, ngứa, nhạy cảm + Thực thể:
• Số lượng vết loột: ớt (1-2), vừa (3-4), nhiều (> hoặc =5)
• Vị trớ vết loột: sinh dục, hậu mụn, vựng mu sinh dục, trờn da, niờm mạc miệng, cỏc vị trớ khỏc...
• Kớch thước vết loột: nhỏ (1-2mm), vừa (3-4mm), to (≥ 5 mm)
• Hỡnh dạng: trũn, oval, nhiều vũng cung, khụng xỏc định...
• Tớnh chất: chắc, mềm
• Tớnh chất vảy tiết: cú hoặc khụng vảy tiết
• Thời gian tồn tại: số ngày
• Số lần tỏi phỏt
2.3.4 Cỏc kỹ thuật xột nghiệm hỗ trợ chẩn đoỏn, định tớp HSV
2.3.4.1 Kỹ thuật chẩn đoỏn tế bào Tzanck
-Sỏt khuẩn vị trớ tổn thương đó chọn bằng cồn 70o
-Lấy kim chủng chọc thủng bọng nước, dựng gúc vuụng của kim nạo nhẹ
nhàng lờn nền của bọng nước, phết bệnh phẩm lờn lam kớnh theo hỡnh trũn
đồng tõm đường kớnh 0,5-1 cm.
-Để bệnh phẩm khụ tự nhiờn ở nhiệt độ phũng -Cố định bằng cồn tuyệt đối
-Nhuộm bằng dung dịch giemsa pha loóng 1/8 trong khoảng 8-10 phỳt -Rửa dưới vũi nước chảy
-Để khụ tự nhiờn ở nhiệt độ phũng
Đọc dưới kớnh hiển vi quang học: dương tớnh khi thấy hỡnh ảnh tế bào biểu mụ cú kớch thước khổng lồ, nhiều nhõn tụ lại thành đỏm, nhõn xốp hoặc cú thể thấy tế bào biểu mụ khổng lồ chỉ cú một nhõn (tế bào gai lệch hỡnh, cú thể cú thể vựi nằm trong nhõn, xung quanh thể vựi cú một vũng sỏng).
2.3.4.2 Kỹ thuật PCR
Bệnh phẩm là dịch tiết vết loột lấy bằng tăm bụng, ngõm trong tube đựng dung dịch PBS. Sau đú, tiến hành chiết tỏch ADN bằng Kit Qiamp DNA Mini Kit của hóng Qiagen theo hướng dẫn của hóng.