C. perfringens phân lập ựược
Sau khi nuôi cấy lần ựầu, các khuẩn lạc nghi là vi khuẩn C. perfringens
ựược tiến hành giám ựịnh ựặc tắnh sinh hóa bao gồm khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu, ựặc tắnh mọc trên môi trường thạch lòng ựỏ trứng, phản ứng CAMP ngược (reverse CAMP test), khả năng ựông vón casein trong môi trường Litmus Milk, khả năng sinh Indol, sản sinh H2S và ựặc tắnh di ựộng.
- Kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn: các chủng vi khuẩn cần kiểm tra ựược ria cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu (có bổ sung 7% máu cừu), nuôi yếm khắ ở 37oC. đọc kết quả sau 24 giờ.
- Kiểm tra hoạt tắnh của men lecithinase: cấy chủng C. perfringens cần kiểm tra trên môi trường thạch lòng ựỏ trứng, nuôi yếm khắ ở 370C/24 giờ. Phản ứng dương tắnh: quan sát thấy khuẩn lạc của vi khuẩn C. perfringens
mọc theo ựường cấy và xung quanh khuẩn lạc tạo thành một vùng mờ ựục. - Kiểm tra ựặc tắnh mọc trên môi trường Litmus Milk (môi trường sữa có 7% chỉ thị Litmus): cho phép kiểm tra ựặc tắnh làm ựông vón casein có trong sữa của vi khuẩn yếm khắ C. perfringens. Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào ống môi trường Litmus Milk, nuôi yếm khắ ở 370C/24 giờ. Phản ứng dương tắnh khi môi trường bị ựông vón, vẩn mây và chuyển màu (từ màu xanh da trời thành màu hồng).
- Kiểm tra khả năng di ựộng: C. perfringens là vi khuẩn duy nhất trong giống Clostridium không có khả năng di ựộng, dựa vào ựặc tắnh này có thể phân biệt với các loài vi khuẩn Clostridium khác. Sử dụng môi trường SIM ựể kiểm tra khả năng di ựộng, ựồng thời kiểm tra khả năng sinh H2S và sinh Indol của vi khuẩn. Sau khi cấy chắch sâu vi khuẩn vào môi trường SIM, nuôi yếm khắ ở 37oC/24 giờ. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc theo ựường cấy ựể ựánh giá khả năng di ựộng. Nếu môi trường có màu ựen là vi khuẩn có sinh H2S. để kiểm tra khả năng sinh Indol, trước khi nhỏ thuốc thử KovacỖs,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 tiến hành hút bỏ lớp parafin ở phắa trên của ống môi trường SIM. Phản ứng dương tắnh khi quan sát thấy một vòng tròn màu ựỏ ở phắa trên mặt môi trường. Phản ứng âm tắnh: không thấy xuất hiện vòng tròn màu ựỏ.
- Thử phản ứng CAMP ngược trên môi trường thạch máu: khi nuôi cấy ựồng thời chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae và C. perfringens trên môi trường thạch máu, do vi khuẩn S. agalactiae tiết ra một loại yếu tố khuyếch tán (CAMP factor) có khả năng cộng hưởng với yếu tố dung huyết không hoàn toàn của vi khuẩn C. perfringens (do ựộc tố α sản sinh ra) khiến cho vùng dung huyết ở gần chỗ tiếp xúc giữa hai ựường cấy sẽ có hình mũi tên rõ ràng. để tiến hành phản ứng CAMP ngược, cấy chủng vi khuẩn C. perfringens cần kiểm tra lên ựĩa thạch máu cừu; sau ựó, cấy vi khuẩn S. agalactiae thành một ựường vuông góc, nhưng không ựược chạm vào với ựường cấy vi khuẩn C. perfringens. Tiến hành nuôi cấy yếm khắ ở 37oC/24 giờ. Phản ứng dương tắnh: quan sát thấy vùng dung huyết ở gần chỗ tiếp xúc giữa hai ựường cấy sẽ có hình mũi tên rõ ràng. Phản ứng âm tắnh: không quan sát thấy dung huyết hình mũi tên.
- Kiểm tra khả năng lên men các loại ựường của C. perfringens: Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch ựường cần kiểm tra (với C. perfringens cần phải cho parafin vào ựể tạo môi trường yếm khắ), cấy vi khuẩn vào, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ ựọc kết quả. Phản ứng dương tắnh khi môi trường chuyển màu hồng, âm tắnh khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban ựầu.