2.2.1 Nguồn nguyên liệu
− Xuất xứ: da cá tra được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An (Binh An Seafood Joint Stock Company), Lô 2.17, Khu Công Nghiệp Trà Nóc II, TP. Cần Thơ.
− Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học ở nhà máy. Sau khi mua về, ta rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bộ các phần mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở khoảng -200C cho đến khi sử dụng.
2.2.2 Hóa chất:
a. Hóa chất dùng để tẩy rửa:
- Chất hoạt động bề mặt LaSNa - Dung dịch NaOH - Dung dịch NaCl - Dung dịch H2O2 b. Hóa chất dùng để xác định thành phần protein: - H2SO4 đậm đặc
- NaOH 40% - H2O2
- Dung dịch NaOH 0.1N chuẩn - Dung dịch H2SO4 0.1N chuẩn - Phenolphtalein
c. Hóa chất dùng để xác định lipid:
- Hệ dung môi : methanol/chloroform - Acetat chì
2.2.3 Dụng cụ - thiết bị
- Máy đo màu
- Máy cất đạm bán tự động GERHARDT, tủ Hotte. - Phiểu lọc hút chân không
- Cân phân tích - Máy đo độ ẩm - Lò nung - Máy so màu CR - 300 - Một số dụng cụ phân tích khác. 2.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.3.1 Phương pháp thí nghiệm:
Phương pháp khảo sát theo yếu tố từng phần. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, chỉ thay đổi một nhân tố còn các nhân tố khác cố định trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được áp dụng cho thí nghiệm sau.
2.3.2 Phương pháp phân tích
2.3.2.1 Xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu
Theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi
Sử dụng tủ sấy:
Tiến hành:
- Sấy đĩa petri trong tủ sấy ở nhiệt độ 105OC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích xác định khổi lượng đĩa petri là mO (g).
- Cho khoảng 2-3 g da cá vào đĩa petri, đem cân ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng đĩa petri và mẫu là m1(g)
- Đặt đĩa petri vào tủ sấy ở nhiệt độ 105OC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy đĩa petri ra và để nguội 15 phút trong bình hút ẩm. Cân khối lượng đĩa petri đã sấy. Cân xong để đĩa petri vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng đĩa petri giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2
(g) - Kết quả tính độ ẩm: (ϕ) 100 * 0 1 2 1 m m m m − − = φ Với : ϕ: Độ ẩm (%)
mO: Khối lượng đĩa petri sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) m1: Khối lượng đĩa petri + khối lượng mẫu (g)
m2: Khối lượng đĩa petri+ khối lượng mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)
Máy sấy khô bằng tia hồng ngoại, máy thường gắn liền với cái cân đặt mẫu. Sau khi trải đều mẫu trên đĩa cân (khoảng 1g) rùi bất nút cho tia hồng ngoại đi qua để làm nóng mẫu và làm bốc hơi nước trong mẫu. Khi kết thúc máy sẽ hiển thị độ ẩm của mẫu lên màn hình
Hình 2.22 – Máy xác định ẩm bằn tia hồng ngoại 2.3.2.2 Xác định hàm lượng chất béo[11]
Nguyên lý: dùng dung môi trích lipid trong nguyên liệu.
a. Hóa chất:
Hệ dung môi : methanol/chloroform Acetat chì
b. Dụng cụ:
- Bình bằng thủy tinh hoặc polyetilen có nắp kín. - Phễu lọc hút chân không.
- Phiễu chiết
- Ống đong, bếp điện - Cân 2 số lẻ
- Giấy lọc
c. Tiến hành:
- Cắt nhỏ da. Cân 5g (độ chính xác 0.01g) nguyên liệu đã cắt nhuyễn, vào 1 bình thủy tinh hoặc polyetilen có nắp kín.
- Cho vào 20ml methanol, khuấy trộn cho đến khi hỗn hợp biến thành một dung dịch nhũ tương đồng nhất. Thêm vào 10ml chloroform và lắc đều trong 10 phút (tốc độ 160-170 vòng/phút). Tiếp tục thêm 10ml chloroform và lắc thêm 5 phút. Cho thêm 10ml dung dịch acetat chì 2% và lắc tiếp trong 30 giây.
- Lọc hỗn hợp qua giấy lọc bằng phễu lọc hút chân không. Trong thời gian lọc, tốt nhất là dùng dòng khó CO2 hoặc N2 để bảo vệ dung dịch khỏi bị oxy hóa. Cuối quá trình lọc, tăng độ chân không để tách được hết dung môi.
- Dùng giấy lọc & bã cho lại vào bình trích và trích ly lần thứ 2 với 15ml chloroform.
- Chuyển toàn bộ dịch lọc vào phễu chiết. Đợi phân lớp hoàn toàn, Lấy riêng lớp chloroform cho vào ống đông để xác định thể tích.
- Lấy thể tích xác định dung dịch này (chứa khoảng 200-300mg chất béo) sấy đến khối lượng không đổi 102-1050C, sau đó đuổi dung môi trên bếp cách thủy ở 40-500C. Cân chất còn lại.
d. Công thức:
- Hàm lượng lipid thô trong nguyên liệu:
100 * * * 1 m V V a C = Với:
C : hàm lượng lipid trong mẫu (%)
a: khối lượng lipid trong phần mẫu xác định (g) V: tổng thể tích dung dịch chloroform (ml) V1: thể tích chloroform mang đi sấy (ml) m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
2.3.2.3 Xác định hàm lượng nitơ và protein tổng [12]
Hàm lượng nitơ tổng và protein tổng của phẩm vật được xác định bằng phương pháp Micro-Kjeldahl.
a. Nguyên tắc:
Khi đốt nóng mẫu vật cần phân tích với H2SO4 đậm đặc thì các hợp chất hữu cơ sẽ bị oxy hóa. Các nguyên tố carbon và hydro lần lượt tạo thành khí CO2 và H2O, còn nguyên tố nitơ được giải phóng ra dưới dạng khí NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Kế đến, đuổi khí NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N chuẩn. Sau đó, tiến hành định phân lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ có trong nguyên liệu phân tích ban đầu.
Máy cất đạm bán tự động GERHARDT, tủ Hotte. Bình Kjendahl 50ml Ống đong 25ml Pipette 2ml và 10ml Erlen 500ml Bình định mức 100ml Burette 25ml Becher 100ml và 250ml c. Hóa chất: H2SO4 đậm đặc NaOH 40%
HClO4 tinh khiết
Dung dịch NaOH 0.1N chuẩn
Dung dịch H2SO4 0.1N chuẩn
Phenolphtalein
d. Cách tiến hành:
Vô cơ hóa mẫu:
Giai đoạn vô cơ hóa được tiến hành trong tủ Hotte. Lấy 5ml mẫu lỏng (hoặc 0.2 – 0.5g mẫu rắn) cho vào bình Kjeldahl. Thêm vào từ từ 10ml H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84g/ml).
Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa, cần cho thêm xúc tác để làm tăng nhiệt độ sôi, làm tăng nhanh quá trình phản ứng, tốt nhất là dùng 0.5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100 : 10 : 1). Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng hỗn hợp CuSO4 : K2SO4 (1: 3), hoặc HClO4 tinh khiết hoặc H2O2 giải phóng O2 cho phản ứng. Ở đây tôi dùng H2O2.
Sau khi thêm chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng (đối với mẫu rắn). Trong quá trình đun, thỉnh
thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho đến khi dung dịch chuyển thành trắng và trong suốt hoàn toàn.
Cất đạm:
Tiến hành trong máy cất đạm bán tự động GERHARDT của Đức. Chuẩn bị máy cất đạm.
Chuyển toàn bộ lượng dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjendahl vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho đến vạch định mức. Chú ý phải làm lạnh vì khi pha loãng acid thì nhiệt tỏa ra rất mạnh và phải lắc thật đều để tránh sai số.
Lấy vào erlen 10ml dung dịch H2SO4 0.1N chuẩn và lắp vào máy.
Tiếp theo, lấy vào ống phản ứng 10ml mẫu từ bình định mức và lắp vào máy. Chú ý không lắp lệch để tránh khí thoát ra ngoài làm mất mẫu.
Khi phản ứng kết thúc, lấy erlen ra và định mức bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn có nhỏ vài giọt Phenolphtalein.
e. Công thức tính kết quả:
Hàm lượng nitơ tổng:
Đối với nguyên liệu dạng lỏng:
V bT a x * 10 1000 * 100 * 0014 . 0 * ) ( − =
Đối với nguyên liệu dạng rắn:
m bT a y * 10 100 * 100 * 0014 . 0 * ) ( − = Trong đó:
x: lượng nitơ tổng có trong mẫu nguyên liệu dạng lỏng (g/l)
y: lượng nitơ tổng có trong mẫu nguyên liệu dạng rắn (g/100g mẫu) a: thể tích dung dịch H2SO4 0.1N dùng để hấp thụ NH3 (ml)
b: thể tích dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ (ml) T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
V: thể tích mẫu nguyên liệu dạng lỏng (ml) m: khối lượng mẫu nguyên liệu dạng rắn (g)
Hàm lượng protein tổng:
2.3.2.4 Xác định hàm lượng tro tổng
a. Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của nhiệt độ cao khoảng 600OC, các nguyên tố trong hợp chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành các khí CO2, hơi H2O, N2, SO2...., lượng tro còn lại trong mẫu bao gồm các oxide của kim loại Na, K, Ca, Mg, Si, Al, Fe,...
b. Cách tiến hành:
- Sấy và cân khối lượng chén nung đến khi không đổi. Cân mẫu nguyên liệu cần phân tích cho vào chén nung, rồi đem đun trên bếp điện đến khi không còn khói đen bốc lên, sau đó đem chén nung chứa mẫu nguyên liệu cho vào tủ nung và chỉnh nhiệt độ ở 600oC. Thời gian nung trong lò khoảng 4 – 6 giờ.
- Sau đó, nếu như tro còn chưa trắng thì nhỏ vài giọt H2O2 rồi tiếp tục nung tiếp cho đến khi tro chuyển sang màu trắng hoàn toàn, lấy chén nung ra cho vào bình hút ẩm để nhiệt độ trở lại bình thường (thời gian khoảng 40 – 60 phút). Sau đó lấy chén nung ra đem cân khối lượng.
- Kế đến, tiếp tục nung chén ở nhiệt độ trên khoảng 30 phút và tiến hành tương tự cho đến khi khối lượng giữa 2 lần cân chênh lệch nhau không quá 0.5%.
c. Công thức tính kết quả: 100 * 3 2 1 m m m x= − Với:
x : hàm lượng tro tổng có trong mẫu nguyên liệu (% theo khối lượng) m1: khối lượng chén nung có chứa tro (g)
m2: khối lượng của chén nung (g)
2.3.2.5 Phương pháp đo độ màu [13]
Giới thiệu không gian màu CIELAB
Hình 2.23 – Không gian màu CIELAB
Để thuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màu sắc CIELAB. Trong đó sử dụng 3 thông số:
L*: độ sáng
a*: tọa độ màu trên trục đỏ - lục b*: tọa độ màu trên trục vàng – lam
Trong hệ thống CIELAB, sự khác nhau giữa các điểm được biểu thị trong không gian màu tương ứng với những khác biệt có thể nhìn thấy được giữa các màu. Không gian màu CIELAB được thiết lập ở dạng lập phương. Trục L* chạy từ đỉnh xuống đáy. Giá trị cực đại của L* là 100, tương ứng với màu trắng. Giá trị cực tiểu của L* là 0, tượng trưng cho màu đen. Các trục a* và b* không có giới hạn các giá trị số cụ thể. Giá trị dương của a* biểu thị cho màu đỏ, giá trị âm biểu thị màu xanh lục. Giá trị dương của b* thể hiện màu vàng, giá trị âm thể hiện màu xanh lam.
Có những giá trị delta đi kèm với hệ thống CIELAB. Các giá trị ∆L*, ∆a*, ∆b* cho biết mẫu chuẩn và mẫu thử khác nhau như thế nào về các giá trị L*, a*,b*. Những giá trị delta này thường được sử dụng cho sự quản lý chất lượng và hiệu chỉnh công thức. Cần thiết lập những mức giới hạn cho các giá trị delta này. Các giá trị delta nằm ngoài giới hạn cho biết có quá nhiều khác biệt giữa mẫu chuẩn và mẫu thử.
•∆L* = *tan *
dard s sample L
L − : sự khác nhau về độ sáng giữa 2 màu
− Nếu ∆L* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng sáng lên, mẫu thử sáng hơn mẫu chuẩn
− Nếu ∆L* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng tối hơn, mẫu thử tối hơn mẫu chuẩn
•∆a* = asample* −a*standard: sự khác nhau về tọa độ trên trục đỏ - lục
− Nếu ∆a* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng đỏ lên, mẫu thử có sắc đỏ hơn mẫu chuẩn
− Nếu ∆a* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lục hơn, mẫu thử có sắc xanh lục hơn mẫu chuẩn
•∆b* = *tan *
dard s sample b
b − : sự khác nhau về tọa độ trên trục vàng - lam
− Nếu ∆b* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng vàng hơn, mẫu thử có sắc vàng hơn mẫu chuẩn
− Nếu ∆b* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lam hơn, mẫu thử có sắc xanh lam hơn mẫu chuẩn
Giới thiệu không gian màu CIELCH
Hình 2.24 – Không gian màu CIELCH
Không gian màu L*C*h* sử dụng chung giản đồ với không gian màu L*a*b* nhưng thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ.
Trong không gian màu này, L* biểu thị độ sáng giống với L* trong không gian màu L*a*b*, C* là cường độ màu và h* là góc tông màu.
Giá trị cường độ màu C* bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm.
Giá trị góc tông màu được xác định khởi điểm tại trục a* và được tính bằng đơn vị độ :
900 là +b* (Vàng) 1800 là –a* (Lục) 2700 là –b* (Lam)
Các giá trị C* và h* được xác định từ a* và b* theo công thức : Cường độ màu C* = (a*)2 +(b*)2 Góc tông màu = − * * 1 * tan a b h * 2 * 1 * C C C = −
∆ : sự khác nhau về độ bão hòa giữa hai màu
* 2 * 1 * h h h = −
∆ : sự khác nhau về tông giữa hai màu ∗ Chú ý
Mục đích chính của quá trình tẩy màu là làm cho da trắng, sáng lên. Do đó, trong quá trình này trục màu chính cần quan tâm là trục màu trắng – đen (L*). Trục a* và b* được xem là 2 trục màu phụ để khảo sát sự thay đổi của ánh màu phụ trong quá trình xử lý.
2.3.2.6 Xác định tổng lượng collagen trong da cá
Xác định bằng phương pháp định lượng hydroxyproline [14]
Nguyên tắc
Trong tổng lượng amino acid có trong collagen, hydroxyproline chiếm khoảng 14 %. Loại amino acid này gần như chỉ được tìm thấy trong collagen mà không có trong bất kỳ một loại protein nào khác của cơ thể, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyproline.
Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole. Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino) benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà). Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline.
Tiến hành
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: lấy 25 mg bột hydroxyproline tinh khiết hòa tan vào 250 ml nước (100 µg/ml). Kế tiếp, lấy 50, 75, 100 và 150 µl của dung dịch này và thêm nước