1.3.1 Một số phương pháp phân loại những phần phi collagen
1.3.1.1 Phương pháp theo Nagai và Suzuki [6] - Nguyên liệu:
Cá ocellate puffer (T. rubripes) được mua từ siêu thị bán sỉ trong thành phố Shimonoseki, Yamaguchi Prefecture, Nhật. Da được loại ra, sau đó cắt thành từng miếng nhỏ, và tồn trữ ở -250C cho đến lúc sử dụng.
- Phương pháp:
Collagen được xử lý theo phương pháp của Nagai và Suzuki (2000a). Tất cả các bước được tiến hành ở nhiệt độ 40C. Da được xử lý với NaOH 0.1N để loại những phần protein phi collagen và các sắc tố, sau đó được rửa với nước cất và làm khô lạnh. Da lạnh khô được xử lý với rượu butylic 10% để loại chất béo trong 2 ngày cứ sau 1 ngày nó được rửa với nước cất và được sấy thăng hoa.
Cuối cùng lấy phần trên đem đi chiết xuất với acid acetic trong 3 ngày để thu được dịch collagen.
1.3.1.2 Phương pháp Gudmundsson và Hafsteinsson (1997) [7]
- Nguyên liệu:
Da của Cá tuyết Baltic (Gadus morhua) được loại ra bằng thiết bị. Phần mô bám dính vào da được loại bằng tay. Sau đó tồn trữ da ở 200C trong những túi polyethylene.
- Phương pháp:
a. Loại lipid: (thêm 0.5% chất hoạt động bề mặt LASNa vào mỗi lần ngâm)
- Ngâm da cá trong dung dịch NaOH 0.2%, mỗi lần ngâm là 1h, ngâm 3 lần. (chú ý: sau mỗi lần ngâm là phải rửa với nước đến khi pH bằng 7)
- Ngâm trong dung dịch H2SO4 0.2%, tương tự trên. - Ngâm trong dung dịch acid citric 0.7 %, tương tự trên. b. Loại màu, mùi:
- Ngâm da cá trên trong dd NaCl 10%, nhiệt độ phòng (250C), trong 24h. - Ngâm da cá trong dung dịch Na0H 0.01 M có H2O2 1%.
Hình 1.20 – Quy trình xử lý da của Gudmundsson và Hafsteinsson
Da sau khi xử lí sẽ được chiết trong acid acetic trong 3 ngày để thu được collagen.
1.3.1.3 Phương pháp dùng muối [8]
Trộn lẫn muối với da cá, sau đó để da cá có lẫn muối trong điều kiện lạnh để tẩy nhờn và khử mùi.
- Bước 1: Muối ( NaCl, KCl,…) trộn với da cá để loại phần phi collagen khỏi da cá, dưới ảnh hưởng của muối da cá đồng thời được tẩy nhờn và khử mùi.
- Bước 2: Loại muối và các phần phi collagen khỏi da, đặc biệt là loại chất béo và khử mùi
- Bước 3: Da sau khi xử lí sẽ được đem đi chiết để thu được collagen.
Phương pháp sử dụng muối được dùng hiệu quả trong quá trình loại các phần phi collagen từ da, đó là phương pháp vừa đơn giản lại vừa kinh tế.
1.3.1.4 Phương pháp đề nghị [9]
Da chứa những phần phi collagen như lipid, chất béo, sắc tố, chất nhờn, protein phi collagen, elastin, và một số thành phần phức tạp khác.
Có nhiều phương pháp khác nhau được dùng để loại phần phi collagen. Một số phương pháp phổ biến sử dụng một hoặc nhiều dung dịch kiềm loãng như Na2CO3 hoặc NaOH. Với phương pháp này, ngoài hiệu quả trong việc loại protein phi collagen đặc biệt nó còn loại một lượng lớn chất béo để loại ra nhiều những đặc tính không mong muốn như là mùi.
Ngoài ra việc loại phần phi collagen là chất béo có thể dùng nhiều cách khác nhau, gồm cả phương pháp vật lý và hóa học. Trong một số trường hợp người ta loại béo bằng cách ngâm rửa với các dung môi hoặc chất tẩy rửa. Có thể sử dụng ethyl alcohol, acetonitrile, hexane, pentane hoặc acetone.
Phần phi collagen bao gồm 2 phần:
- Phần có nhiều mỡ chứa lipid, sắc tố, chất nhờn. Chất béo gây màu và mùi không mong muốn trong collagen.
- Phần protein phi collagen chứa myosin, elastin, hexosamine, và những phần không phải chất béo.
Dung dịch chất hoạt động bề mặt (có thể dung chất hoạt động bề mặt phi ion hoặc là chất hoạt động bề mặt anion) chứa ít hơn 0.2% chất hoạt động thì nó loại phần phi collagen từ da rất chậm, bởi vậy thực tế ít được quan tâm. Mặc khác, dụng dịch chất hoạt động bề mặt chứa hơn 5% chất hoạt động có hoạt tính bề mặt thấp hơn so với dung dịch loãng hơn và thừa nhiều sẽ gặp vấn đề trong việc loại chất bề mặt ra khỏi da về sau. Vì vậy người ta thường sử dụng chất hoạt động bề mặt trong khoảng nồng độ 0.2-5%.
Khi cho da tiếp xúc với dung dịch chất hoạt động 1% hoặc với 1 dãy dung dịch chất hoạt động 0.2% thì ta thu được kết quả tương tự nhau. Thời gian đòi hỏi để loại phần
phi collagen phụ thuộc vào nồng độ chất hoạt động bề mặt, nhiệt độ xử lý, và số lượng phần phi collagen có mặt trong da. Nói chung thời gian xử lý ít nhất khoảng 16h. Nhiệt độ khoảng từ 32.3-37.8 0C) là thích hợp.
Nếu chỉ sử dụng chất hoạt động bề mặt thì loại được 37% phần phi collagen từ da, còn nếu kết hợp với kiềm thì loại được 70% phần phi collagen. Sau khi loại các phần phi collagen ta tiến hành tẩy màu bằng dung dịch H2O2 loãng.
1.3.2 Những nghiên cứu về collagen ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.2.1 Tình hình sản xuất collagen hiện nay
Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp, collagen được trích ly chủ yếu từ da, xương của các loại gia súc và lợn. Khoảng thời gian gần đây, sự bùng phát của các loại bệnh truyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine Spongiform Encephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồm long móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạn chế phạm vi sử dụng của collagen có nguồn gốc từ chúng bởi vì có khả năng lây truyền những bệnh này sang con người thông qua các mô của động vật. Thêm vào đó, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng vì rào cản tôn giáo. Với những nguyên nhân trên, các nhà khoa học đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra những nguồn collagen thay thế. Da, xương, vây, vảy của cả những loài cá nước ngọt và cá biển, da gà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thay thế [10].
Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp một nguồn nguyên liệu thô tốt nhất vì: - Dễ tìm, sẵn có để sử dụng
- Không có sự lây truyền bệnh
- Không gặp phải trở ngại về mặt tôn giáo
Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dưới dạng các phế phẩm như da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốt quá trình chế biến. Việc tận dụng những chất thải này có thể nâng giá trị kinh tế của các loài cá lên.
Tổng lượng collagen trong cơ thể thay đổi từ 3,26 % (ở cá thu) cho đến 6,97% (ở cá chình Nhật Bản). Lượng collagen có thể hòa tan trong acid nằm trong khoảng từ 13,1 % (cá chình) đến 56,6 % (cá bơn). Hàm lượng collagen thu được sẽ thay đổi tùy theo loài và loại mô được sử dụng trong quá trình trích ly. Trong tất cả các loài, khả năng hòa tan của collagen trong thịt tương đối cao nhưng thấp đối với những loại collagen trong nội tạng. Collagen trong da, vảy, xương và vây chiếm phần lớn trong tổng lượng collagen.
1.3.3 So sánh collagen từ cá và collagen từ các loại gia súc
Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc. Bởi sự bộc phát của bệnh bò điên BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – mad cow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá. Nó có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong y học và mỹ phẩm. Mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người. Đối mặt với vấn đề này, liệu pháp tiêm collagen vào da được giới thiệu. Tuy nhiên, những bất lợi của cách thức này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro. Giờ đây, các nhà khoa học Phần Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá. Không giống với những loại collagen thu được từ những phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người. Cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khác nhau. Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học.
Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn.
Hình 1.21 – Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và tự lợn
Chương 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI:
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch LASNa và nồng độ của dung dịch NaOH lên quá trình loại lipid.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên quá trình loại lipid.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại màu da cá Tra: nồng độ dung dịch H2O2, nồng độ dung dịch NaOH, thời gian tẩy màu, tỉ lệ da/dung dịch H2O2
trong NaOH
2.2 NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT – DỤNG CỤ:2.2.1 Nguồn nguyên liệu 2.2.1 Nguồn nguyên liệu
− Xuất xứ: da cá tra được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An (Binh An Seafood Joint Stock Company), Lô 2.17, Khu Công Nghiệp Trà Nóc II, TP. Cần Thơ.
− Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học ở nhà máy. Sau khi mua về, ta rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bộ các phần mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở khoảng -200C cho đến khi sử dụng.
2.2.2 Hóa chất:
a. Hóa chất dùng để tẩy rửa:
- Chất hoạt động bề mặt LaSNa - Dung dịch NaOH - Dung dịch NaCl - Dung dịch H2O2 b. Hóa chất dùng để xác định thành phần protein: - H2SO4 đậm đặc
- NaOH 40% - H2O2
- Dung dịch NaOH 0.1N chuẩn - Dung dịch H2SO4 0.1N chuẩn - Phenolphtalein
c. Hóa chất dùng để xác định lipid:
- Hệ dung môi : methanol/chloroform - Acetat chì
2.2.3 Dụng cụ - thiết bị
- Máy đo màu
- Máy cất đạm bán tự động GERHARDT, tủ Hotte. - Phiểu lọc hút chân không
- Cân phân tích - Máy đo độ ẩm - Lò nung - Máy so màu CR - 300 - Một số dụng cụ phân tích khác. 2.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.3.1 Phương pháp thí nghiệm:
Phương pháp khảo sát theo yếu tố từng phần. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, chỉ thay đổi một nhân tố còn các nhân tố khác cố định trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được áp dụng cho thí nghiệm sau.
2.3.2 Phương pháp phân tích
2.3.2.1 Xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu
Theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi
Sử dụng tủ sấy:
Tiến hành:
- Sấy đĩa petri trong tủ sấy ở nhiệt độ 105OC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích xác định khổi lượng đĩa petri là mO (g).
- Cho khoảng 2-3 g da cá vào đĩa petri, đem cân ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng đĩa petri và mẫu là m1(g)
- Đặt đĩa petri vào tủ sấy ở nhiệt độ 105OC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy đĩa petri ra và để nguội 15 phút trong bình hút ẩm. Cân khối lượng đĩa petri đã sấy. Cân xong để đĩa petri vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng đĩa petri giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2
(g) - Kết quả tính độ ẩm: (ϕ) 100 * 0 1 2 1 m m m m − − = φ Với : ϕ: Độ ẩm (%)
mO: Khối lượng đĩa petri sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) m1: Khối lượng đĩa petri + khối lượng mẫu (g)
m2: Khối lượng đĩa petri+ khối lượng mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)
Máy sấy khô bằng tia hồng ngoại, máy thường gắn liền với cái cân đặt mẫu. Sau khi trải đều mẫu trên đĩa cân (khoảng 1g) rùi bất nút cho tia hồng ngoại đi qua để làm nóng mẫu và làm bốc hơi nước trong mẫu. Khi kết thúc máy sẽ hiển thị độ ẩm của mẫu lên màn hình
Hình 2.22 – Máy xác định ẩm bằn tia hồng ngoại 2.3.2.2 Xác định hàm lượng chất béo[11]
Nguyên lý: dùng dung môi trích lipid trong nguyên liệu.
a. Hóa chất:
Hệ dung môi : methanol/chloroform Acetat chì
b. Dụng cụ:
- Bình bằng thủy tinh hoặc polyetilen có nắp kín. - Phễu lọc hút chân không.
- Phiễu chiết
- Ống đong, bếp điện - Cân 2 số lẻ
- Giấy lọc
c. Tiến hành:
- Cắt nhỏ da. Cân 5g (độ chính xác 0.01g) nguyên liệu đã cắt nhuyễn, vào 1 bình thủy tinh hoặc polyetilen có nắp kín.
- Cho vào 20ml methanol, khuấy trộn cho đến khi hỗn hợp biến thành một dung dịch nhũ tương đồng nhất. Thêm vào 10ml chloroform và lắc đều trong 10 phút (tốc độ 160-170 vòng/phút). Tiếp tục thêm 10ml chloroform và lắc thêm 5 phút. Cho thêm 10ml dung dịch acetat chì 2% và lắc tiếp trong 30 giây.
- Lọc hỗn hợp qua giấy lọc bằng phễu lọc hút chân không. Trong thời gian lọc, tốt nhất là dùng dòng khó CO2 hoặc N2 để bảo vệ dung dịch khỏi bị oxy hóa. Cuối quá trình lọc, tăng độ chân không để tách được hết dung môi.
- Dùng giấy lọc & bã cho lại vào bình trích và trích ly lần thứ 2 với 15ml chloroform.
- Chuyển toàn bộ dịch lọc vào phễu chiết. Đợi phân lớp hoàn toàn, Lấy riêng lớp chloroform cho vào ống đông để xác định thể tích.
- Lấy thể tích xác định dung dịch này (chứa khoảng 200-300mg chất béo) sấy đến khối lượng không đổi 102-1050C, sau đó đuổi dung môi trên bếp cách thủy ở 40-500C. Cân chất còn lại.
d. Công thức:
- Hàm lượng lipid thô trong nguyên liệu:
100 * * * 1 m V V a C = Với:
C : hàm lượng lipid trong mẫu (%)
a: khối lượng lipid trong phần mẫu xác định (g) V: tổng thể tích dung dịch chloroform (ml) V1: thể tích chloroform mang đi sấy (ml) m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
2.3.2.3 Xác định hàm lượng nitơ và protein tổng [12]
Hàm lượng nitơ tổng và protein tổng của phẩm vật được xác định bằng phương pháp Micro-Kjeldahl.
a. Nguyên tắc:
Khi đốt nóng mẫu vật cần phân tích với H2SO4 đậm đặc thì các hợp chất hữu cơ sẽ bị oxy hóa. Các nguyên tố carbon và hydro lần lượt tạo thành khí CO2 và H2O, còn nguyên tố nitơ được giải phóng ra dưới dạng khí NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Kế đến, đuổi khí NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N chuẩn. Sau đó, tiến hành định phân lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ có trong nguyên liệu phân tích ban đầu.
Máy cất đạm bán tự động GERHARDT, tủ Hotte. Bình Kjendahl 50ml Ống đong 25ml Pipette 2ml và 10ml Erlen 500ml Bình định mức 100ml Burette 25ml Becher 100ml và 250ml c. Hóa chất: H2SO4 đậm đặc NaOH 40%
HClO4 tinh khiết
Dung dịch NaOH 0.1N chuẩn
Dung dịch H2SO4 0.1N chuẩn
Phenolphtalein
d. Cách tiến hành:
Vô cơ hóa mẫu:
Giai đoạn vô cơ hóa được tiến hành trong tủ Hotte. Lấy 5ml mẫu lỏng (hoặc 0.2 –