Khẳng định:

Bước 1: Chọn lọc và thuần hĩa các khuẩn lạc lấy để khẳng định:

- Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi dĩa được chọn ở mục VI, nếu cĩ ít hơn 5 khuẩn lạc trên mỗi dĩa, chọn tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ để khẳng định. - Nếu các dĩa mọc quá dày khĩ cĩ thể chọn khuẩn lạc phân lập tốt, cấy via 5khuẩn lạc nghi ngờ trên dĩa thạch MYP, ủ trong tủ ấm 300C±10C trong 18 – 24h. Chọn ít nhất 1 khuẩn lạc rõ ràng, cĩ màu hồng từ đĩa này để tiến hành khẳng định.

Bước 2: Trên mơi trường glucose – agar:

Dùng que cấy trịn lấy các khuẩn lạc được chọn vào ống nghiệm chứa mơi trường glucose –agar đã được làm tan chảy. Ủ các ống nghiệm ở 300C±10C trong 24h. Nếu cả ống nghiệm cĩ màu vàng, thường kèm theo cĩ sinh khí thì chứng tỏ khuẩn lạc cho phản ứng glucose dương tính.

Bước 3: Phản ứng trên mơi trường V.P:

- Cấy chuyền các khuẩn lạc chọn lọc vào ống nghiệm chứa mơi trường V.P.Ư trong tủ ấm 300C±10C trong 24h.

- Chuyển 1mL canh trùng vào ống nghiệm sạch để thử acetylmethylcarbinol thêm 0.2mL KOH 40%; 0.6mL alpha-naphthol và 1 vài tinh thể creatine, lắc mạnh và để yên 1h. Phản ứng dương tính sẽ cho màu hồng eosin trong ống nghiệm.

Bước 4: Trên mơi trường nitrat:

- Cấy chuyền các khuẩn lạc chọn lọc vào ống nghiệm chứa mơi trường nitrat. Ủ trong tủ ấm ở 300C±10C trong 24h.

- Kiểm tra phản ứng khử nitrat bằng cách thêm (0.2 – 0.5)mL thuốc thử nitrit vào mỗi ống nghiệm.

Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát

- Nếu cĩ màu đỏ xuất hiện thì đã cĩ phản ứng nitrat thành nitrit. Nếu khơng cĩ màu đỏ xuất hiện trong 15s, thêm 1 ít bột kẽm và để yên 10 phút vẫn khơng cĩ màu đỏ xuất hiện thì phản ứng nitrat âm tính.

3.4.10.7 Tính kết quả

3.4.10.7.1 Tính tốn kết quả:

Nếu 80% số khuẩn lạc nghi ngờ được chọn để khẳng định thì lấy tất cả các khuẩn lạc đếm được để tính kết quả. Cịn trong các trường hợp khác, tính tĩan số lượng Bacillius cereus từ phần trăm của cereus đếm được ở trên.

Trường hợp tổng trung bình của các khuẩn lạc khẳng định ở nhỏ hơn 15, báo cáo kết quả như sau:

X = (Y x ne) bacillus cereus/mL (g). Trong đĩ:

ne = 1/V; V: thể tích mẫu hút để cấy; Y: số khuẩn lạc nhỏ hơn 15.

- Trường hợp cĩ pha lỗng ne = 1/V x 1/d Trong đĩ, d: độ pha lỗng của mẫu.

- Trường hợp khơng cĩ khuẩn lạc nào được khẳng định là Bacillus cereus trên mẫu ban đầu (dạng lỏng) hoặc với dung dịch huyền phù ban đầu (đối với sản phẩm dạng khác) thì biểu diễn kết quả như sau:

X = Y x ne bacillus cereus /g (mL) Y: số khuẩn lạc nhỏ hơn 1