4. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
2.3.3.2.Phương pháp kháng sinh đồ
Các chủng P. multocida phân lập được xác định tính mẫn cảm kháng sinh theo phương pháp của Kirby-Bauer (1980).
Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida thử được cấy vào môi trường BHI và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Lấy 0,5ml canh trùng pha loãng đến hiệu giá 10-4. Dùng pipetman hút 0,2ml canh trùng đã pha
Kiểm tra đ ặc tính sinh vật, hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa
Oxidase (+), Calatase (+), Indole (+)
Thử phản ứng lên men đ ường, khả năng dung
huyết
Thử đ ộc lực Kháng sinh đ ồ Giữ giống
bằng phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
Trâu, bò trong các ổ dịch cũ, lấy máu tĩnh mạch cổ, để đông tự nhiên trong điều kiện vô trùng ở 4-8oC, chắt lấy huyết thanh để xác định hàm lượng kháng thể chủ động tự nhiên đối với bệnh tụ huyết trùng.
Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể P. multocida:
- Gắn kháng nguyên đã biết (P. multocida) lên pha rắn; rửa bằng PBS để loại bỏ kháng nguyên thừa.
- Cho vào giếng phản ứng huyết thanh cần chẩn đoán (có thể có hoặc không có kháng thể nghi P. multocida). Nếu có kháng thể đặc hiệu, tương ứng sẽ xảy ra kết hợp KN-KT, rửa PBS để loại bỏ kháng thể thừa.
- Cho kháng kháng thể tương ứng đã gắn enzym (enzym HRPO), rửa PBS để loại bỏ conjugate thừa.
- Cho cơ chất tương ứng với enzym (cơ chất TMB substrate).
- Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, dừng phản ứng bằng H2SO4.4N. Đọc kết quả bằng quang phổ kế ở bước sóng 650nm.
Trong trường hợp huyết thanh nghi không có kháng thể tương ứng, phức hợp KN-KT sẽ không tạo thành nên không xảy ra bước tiếp theo KT-KKT do phần kháng thể thừa ở bước hai đã bị rửa trôi, cơ chất không có enzym tương ứng phân huỷ nên không tạo màu, quang phổ kế cho kết quả âm tính.
Tương tự như trên đối với các mẫu huyết thanh xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch tại các thời điểm san khi tiêm phòng vắc xin trên cơ sở kiểm tra hàm lượng kháng thể trong mẫu máu trâu, bò thí nghiệm và đối chứng.
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Minitab và máy tính cá nhân với các thông số thống kê. (Chu Văn Mẫn, 2001[19])
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn trên địa bàn tỉnh Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Bằng từ năm 2008 - 2011
Việc xác định số trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng hàng năm, mùa phát bệnh và sự ảnh hưởng của khí hậu thời tiết tới sự phát sinh và lây lan bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Cao Bằng là cơ sở khoa học để chủ động đề ra các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả tiến tới thanh toán bệnh. Để thực hiện được mục đích trên, từ năm 2008 - 20011 dựa trên các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học, quan sát triệu chứng, bệnh tích và các số liệu lưu trữ của Chi cục Thú y, chúng tôi tiến hành điều tra số trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng và chết trên địa bàn tỉnh. Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Thời gian (năm ) Tổng đàn gia
súc (con) Tình hình gia súc mắc bệnh tụ huyết trùng
Trâu bò Lợn Trâu bò Lợn Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) Số mắc bện h (con ) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) 2008 24678 9 311877 815 0.33 455 55.8 2 2063 0.66 673 32.62 23416 47.1
4 9 x X ± m 0.34 7 ± 0.02 6 39.3 9 ± 7.50 0.65 5 ± 0.03 8 24.02 ± 3.78
Từ bảng 3.1, các kết quả thu được cho thấy: Tại Cao Bằng, trong khoảng thời gian này (4 năm), tỷ lệ trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là khá cao. Ở trâu, bò đã có (0.347 ± 0.026)% số trâu bò mắc bệnh so với tổng đàn và tỷ lệ chết so với số trâu, bò ốm là (39.39 ± 7.50)%. Ở Lợn tỷ lệ ốm là (0.655 ± 0.038)% và tỷ lệ chết so với ốm là (24.02 ± 3.78).
So với kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Văn Dũng (2000)[3] khi nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Lai Châu (0,63%) và kết quả của Nguyễn Đình Trọng (2002)[36] khi điều tra tại tỉnh Bắc Kạn (0,77%) thì tỷ lệ mắc bệnh ở trâu, bò mà chúng tôi điều tra thấp hơn, song kết quả này lại cao hơn kết quả của Cao Văn Hồng (2002)[9] điều tra ở Đắk Lắk (0,18%). Ở lợn thì kết quả điều tra của chúng tôi thấp hơn so với kết quả điều tra của tác giả Đỗ Quốc Tuấn (2008)[37] ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam là 3,54%. Có sự khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh của các tỉnh nói trên có thể lý giải do tập quán chăn nuôi ở mỗi vùng miền khác nhau nên tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau. Ở Lai Châu, Cao Bằng, Bắc Kạn và một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam trâu, bò được nuôi với mục đích chủ yếu là để sử dụng sức kéo cho nông nghiệp và vận chuyển do đó thường gặp các yếu tố stress do ảnh hưởng của sự thay đổi thời tiết, do áp lực của công tác cày kéo nặng nề của mùa vụ, còn ở Đắk Lắk trâu, bò được nuôi với mục đích lấy thịt do vậy mà tỷ lệ mắc bệnh ở đây thấp hơn.
Trong 4 năm điều tra (từ năm 2008 đến năm 2011) chúng tôi thấy tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu bò giao động từ 0.28% đến 0.40%. Năm 2009 đàn trâu bò có tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng cao nhất trong các năm
điều tra. Nguyên nhân chủ yếu là do do mùa đông năm 2009 tỉnh Cao Bằng là khu vực chịu ảnh hưởng mạnh của đợt rét đậm rét hại kéo dài. Trâu, bò vừa bị rét vừa thiếu thức ăn nên tạo điều kiện cho dịch bệnh tụ huyết trùng lan rộng gây thiệt hại lớn.
Qua các số liệu trên cho thấy bệnh tụ huyết trùng xảy ra trên địa bàn tỉnh Cao Bằng khá phổ biến và vẫn là mối đe doạ cho ngành chăn nuôi của tỉnh.
3.1.2. Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ năm 2008 đến năm 2011 năm 2008 đến năm 2011
Mỗi loài gia súc khác nhau có mức độ cảm nhiễm bệnh khác nhau. Để so sánh mức độ cảm nhiễm bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu và đàn bò, chúng tôi tiến hành điều tra số con mắc bệnh tụ huyết trùng và số con chết do mắc bệnh tụ huyết trùng qua bốn năm, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ năm 2008 đến năm 2011 Loài Năm Trâu Bò Số theo dõi (con) Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Số con chết (con) Tỷ lệ chết (%) Số theo dõi (con) Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Số con chết (con) Tỷ lệ chết (%) 2008 132992 487 0.36 307 63.04 113792 328 0.28 148 45.12 2009 131079 591 0.45 323 54.65 103088 360 0.34 165 45.83 2010 130067 428 0.32 156 36.44 109008 257 0.24 67 26.07 2011 131508 587 0.44 152 25.89 110596 332 0.30 51 15.36 Tính chung 525646 2093 0.40 938 44.82 436484 1277 0.29 431 33.75
Qua bảng 3.2 ta thấy: tỷ lệ mắc bệnh của đàn trâu qua 4 năm trung bình là 0.40% trên tổng số đàn. Tỷ lệ này thấp nhất là vào năm 2010 với 0.32% và cao nhất là vào năm 2009 với 0.45%. Tỷ lệ mắc bệnh của bò qua bốn năm điều tra bình quân là 0.29%, thấp nhất là năm 2010 với 0.24% và cao nhất là năm 2009 với 0.34%. So sánh tỷ lệ mắc tính chung qua bốn năm giữa hai đàn trâu bò ta thấy ràng đàn trâu có tỷ lệ mắc cao hơn so với đàn bò. Với độ tin cậy P1 = 0.042<0.05 ta có thể khẳng định sự khác biệt này là rõ rệt.
Tỷ lệ chết so với ốm của đàn trâu qua bốn năm là 44.82%, của đàn bò là 33.75%. Đây là một tỷ lệ chết khá cao. Tuy nhiên ta có thể thấy tỷ lệ chết của đàn trâu đang giảm dần, từ năm 2008 là 63.04% thì tới năm 2011 chỉ còn 25.89%, tương tự ở bò, tỷ lệ chết năm 2008 là 45.12% thì năm 2011 chỉ còn 15.36%. Tỷ lệ chết của đàn trâu bò đều giảm qua các năm có thể do kỹ thuật chẩn đoán, điều trị bệnh của cán bộ thú y cơ sở ngày một năng cao, hơn nữa những năm gần đây, chi cục thú y Cao Bằng luôn quan tâm tới vấn đề tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng cho đàn gia súc nên mặc dù dịch có xảy ra, song mức độ thiệt hại về đầu con đã được khống chế đáng kể. So sánh tỷ lệ chết của đàn trâu và đàn bò do tụ huyết trùng gây ra qua các năm ta thấy sự sai khác nhau giữa hai đàn không có ý nghĩa (P2 = 0.34>0.05).
Kết quả điều tra của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của tác giả De Alwis (1984)[49]:loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu và bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò.
Như vậy tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của trâu bò tại Cao Bằng khá phức tạp. Tỷ lệ mắc bệnh của đàn trâu luôn luôn cao hơn đàn bò, tuy nhiên tỷ lệ chết giữa hai đàn không khác nhau nhiều.
3.1.3. Tần suất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại các huyện từ năm 2008 - 2011 2008 - 2011
Theo nhiều tác giả thì bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là một bệnh có tính địa phương rất đặc trưng. Vì vậy việc xác định tần số xuất hiện dịch tụ huyết
trùng trâu, bò tại các địa phương ở Cao Bằng cũng là một đòi hỏi phục vụ cho công tác phòng chống bệnh.
Kết quả tần xuất xuất hiện dịch tụ huyết trùng tại Cao Bằng được chúng tôi thống kê và thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.3. Tần xuất xuất hiện dịch tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng
Năm Số huyện điều tra số huyện có dịch Tỷ lệ (%)
2008 13 10 76.92 2009 13 13 100 2010 13 12 92.30 2011 13 9 69.23 x X ± m 11 ± 0.91
Qua bảng 3.3 ta thấy dịch tụ huyết trùng trâu bò xảy ra ở tất cả các năm điều tra. Tỷ lệ dịch bệnh xảy ra ở các huyện thị là khá cao. Thấp nhất là năm 2011, có 9 huyện trong tổng số 13 huyện xuất hiện dịch tụ huyết trùng, với tỷ lệ 69.23%, tuy nhiên năm 2009 tỷ lệ này là 100%. Tuy rằng mức độ bùng phát dịch tụ huyết trùng tại các huyện ở Cao Bằng là khác nhau, tuy nhiên tỷ lệ tính chung mức độ bùng phát dịch bệnh ở Cao Bằng là rất mạnh, từ năm 2008 tới năm 2011 đã có trung bình 11 huyện có dịch với độ lệch tiêu chuẩn 0.91.
Kết quả này được giải thích do Cao Bằng là một tỉnh miền núi khó khăn, chăn nuôi chủ yếu là quảng canh (trâu, bò thả trên rừng tự kiếm ăn); Người dân lại có tập quán nhốt chung trâu, bò, lợn, gà… với nhau; Sự nhận thức được vai trò của tiêm phòng còn thấp, khi dịch xảy ra thì hệ thống thú y thôn bản có số lượng ít, trình độ cũng như kinh nghiệm yếu kém, giao thông
nên dịch nổ ra thường xuyên và phức tạp. Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cán bộ thú y địa phương cũng như nâng cao tuyên truyền hiểu biết về bệnh cho nhân dân là một yêu cầu cấp thiết để có thể khống chế sự lây lan của bệnh và tiến tới khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng.
3.1.4. Kết quả điều tra trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ tại Cao Bằng vụ tại Cao Bằng
Điều kiện khí hậu, yếu tố mùa vụ luôn luôn ảnh hưởng trực tiếp tới tình hình mắc bệnh của gia súc, gia cầm. Khí hậu của các tỉnh miền núi phía Bắc thường chia làm 2 mùa vụ rõ rệt là vụ Hè - Thu từ tháng 4 đến tháng 10 và Đông - Xuân từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau. Sự thay đổi và tác động của điều kiện thời tiết, khí hậu mà trong đó nhân tố cơ bản là ẩm độ và nhiệt độ môi trường gây ra những biến đổi cho cơ thể động vật, gây ra stress làm giảm sức đề kháng của gia súc và tăng khả năng mắc bệnh, trong đó có bệnh tụ huyết trùng. Để nghiên cứu tính chất mùa vụ có ảnh hưởng như thế nào đến việc phát sinh và gây chết vì bệnh tụ huyết trùng, chúng tôi đã điều tra số trâu, bò ốm chết vì bệnh tụ huyết trùng trong 4 năm, kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.4. Kết quả xác định tỷ lệ trâu bò mắc bệnh, chết do bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ tại Cao Bằng
Thời gian (năm)
Tổng số trâu,
bò
Số trâu, bò ốm (con) Số trâu, bò chết (con) Đông - Xuân Hè - Thu Đông - Xuân Hè - Thu Số ốm Tỷ lệ (%) Số ốm Tỷ lệ (%) Số chết Tỷ lệ (%)* Số chết Tỷ lệ (%)* 2008 246789 187 0.08 628 0.25 92 49.20 363 57.80 2009 234167 210 0.09 705 0.30 99 47.14 349 49.50 2010 239075 157 0.06 528 0.22 76 48.40 147 27.84 2011 242104 212 0.08 707 0.29 90 42.45 113 15.98 Tính chung 962135 766 0.08 2568 0.26 357 46.60 972 37.85 P = 0.002 P = 0.102 Tỷ lệ (%)*: Chết so với số ốm
Từ bảng 3.4, các kết quả thu được cho thấy, với tổng số 962135 trâu, bò điều tra trong vụ Đông - Xuân có 766 con mắc bệnh chiếm 0.08%, số con chết là 357 con, chiếm 46.60% so với số ốm. Vụ Hè - Thu có 2568 con mắc bệnh, chiếm 0.26%, số con chết là 972 con, chiếm 37.85% so với số ốm. Tỷ lệ mắc bệnh của đần trâu bò tại cao bằng có sự khác biệt rõ ràng giữa hai vụ Đông - Xuân và Hè - Thu (p = 0.002 <0.05). Tuy nhiên tỷ lệ trâu bò chết ở hai vụ trên lại không khác nhau đáng kể (p = 0.102 >0.05)
Điều này hoàn toàn phù hợp với quy luật gây bệnh của vi khuẩn P. multocida và quy luật dịch tễ của bệnh, là vì trong vụ Hè - Thu:
- Thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều, bão lụt… thích hợp với sự phát triển của mầm bệnh và làm giảm sức đề kháng của trâu, bò.
- Trâu, bò thường được thả rông trên đồi rừng, nhiều khi trâu, bò chết mà chủ nuôi không biết hoặc xác chết bị vứt ra sông suối nên khi gặp mưa rào, lụt lội phân và nước tiểu có chứa mầm bệnh có điều kiện lây lan rộng ra các vùng xung quanh. Ngược lại, do vi khuẩn P. multocida thường cư trú ở đường hô hấp trên nên ở vụ Đông - Xuân điều kiện khí hậu khắc nghiệt, thức ăn khan hiếm kết hợp với điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém nên sức đề kháng của trâu, bò giảm vì vậy bệnh cũng có điều kiện phát sinh song không bằng vụ Hè - Thu.
Theo nghiên cứu một cách đầy đủ tại Sri Lanka của De Alwis (1984)[49] cho thấy bệnh xuất hiện quanh năm. Trong khi vào mùa khô bệnh có chiều hướng giảm đi thì sau đó khi chuyển sang mùa mưa thì bệnh lại có khuynh hướng bùng phát rộng ra rất nhanh, có lẽ điều này là do sự tồn tại rất lâu của Pasteurella multocida bên ngoài gia súc và khi gặp điều kiện ẩm ướt
tháng mùa hè. Đặc biệt chú ý đặc điểm mối quan hệ giữa lương mưa rất lớn cùng với hiện tượng lạnh bất thường và sự lan nhanh của bệnh.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận định của Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958)[4] là ở Việt Nam bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra vào mùa mưa, vào các tháng nóng ẩm, mưa nhiều, khí hậu ẩm ướt. Cao Văn Hồng (2002)[9], cho biết bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò ở Đắk Lắk có dịch tễ học với hệ số tháng dịch 5, 6, 7, 8, 9 lớn hơn 1, tức là bệnh thường xảy ra vào