4. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
1.5.Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh
Theo thuật ngữ của Louis Pasteur dùng từ năm 1885 thì “vắc xin” dùng để chỉ một chế phẩm sinh học được chế từ vi sinh vật, để gây miễn dịch phòng bệnh truyền nhiễm. Ngày nay không chỉ có vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm mà còn có vắc xin phòng ký sinh trùng, vì vậy thuật ngữ vắc xin được hiểu rộng hơn, đó là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh gọi là
"kháng nguyên" khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra trạng thái miễn dịch giúp cơ thể chống lại mầm bệnh - tức kháng nguyên. Theo Van Oirchot (1993)[82], tiêu chí để chọn một vắc xin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây:
- Không được gây phản ứng toàn thân. Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất 24 giờ sau khi tiêm phòng.
- Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài. - Sử dụng và bảo quản dễ dàng.
Chƣơng 2
NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
2.1.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò tạiCao Bằng Cao Bằng
- Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011.
- Tần xuất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011.
- Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng ở loài gia súc, mùa vụ, lứa tuổi, vùng địa lý.
- Triệu chứng, bệnh tích đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng. - Nghiên cứu mối tương quan của thời tiết khí hậu của Cao Bằng đến tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò.
2.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng
- Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe trong ổ dịch cũ.
- Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P. multocida từ các mẫu bệnh phẩm của trâu, bò mắc bệnh.
- Xác định serotype vi khuẩn P. multocida phân lập được. - Xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được.
- Thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hoá dược của vi khuẩn P. multocida phân lập được được.
- Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn P. multocida ở trên thực địa.
2.1.3. Đánh giá hiệu lực bảo hộ của một số loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trung trâu, bò trên thực địa huyết trung trâu, bò trên thực địa
- Xác định tình trạng miễn dịch chủ động tự nhiên đối với kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida của trâu, bò trong ổ dịch cũ.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng nhũ hóa của Công ty Navetco.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng keo phèn Xí nghiệp Phùng.
- So sánh sự an toàn và hiệu quả phòng bệnh của hai loại vắc xin nhũ hóa dầu và keo phèn trên thực địa.
2.1.4. Lựa chọn vắc xin và đề xuất biện pháp khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng trâu, bò tại Cao Bằng
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn
Dịch ngoáy mũi lấy từ trâu, bò khỏe mạnh không có triệu chứng lâm sàng. Thu thập bệnh phẩm là máu tim, phổi, tủy xương trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng.
2.2.2. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch khỏe mạnh, có trọng lượng từ 18-22 gam/con.
- Trâu, bò khỏe mạnh không mắc bệnh tụ huyết trùng và chưa được tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng.
2.2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.2.3.1. Hóa chất thí nghiệm - Hóa chất dùng để nhuộm Gram - Hóa chất dùng để nhuộm Gram
- Dung dịch tím tinh thể Crystal violet - Dung dịch đỏ Fucshin.
demethyl bezada trộn với 75 ml cồn Butylic hoặc Izoamylie đặt vào nồi đun cách thủy 50-600C. Sau đó cho từ từ từng giọt 25ml HCl đặc, để qua đêm đến khi xuất hiện màu vàng.
- Thuốc thử phản ứng Catalasa: Dùng H2O2 3%.
- Giấy thử Oxydase do Úc sản xuất: Dung dịch Tetramenthyip- Phinylane diamine dihydrochloride 1%, để ở nhiệt độ phòng, giấy lọc được cắt thành giải, nhúng vào dung dịch để khô và giữ ở 400
C.
- Các loại đường để thử phản ứng: Glucosa, Fructosa, Lactosa, Mannit, Dulciton, Manitol.
- Giấy thử kháng sinh đồ: Giấy thử kháng sinh đồ của công ty Nam Khoa Thành phố Hồ Chí Minh.
- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
- Môi trường thạch thường Plate Count Agar. - Môi trường thạch máu Blood base Agar. - Môi trường thạch MacConkey Agar.
- Môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI). - Môi trường Nutrient broth.
- Môi trường thạch nghiêng Triple sugar iron agar (TSI). - Thạch Mueller Hilton Agar
2.2.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Các trang thiết bị, máy móc có tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên; bộ môn vi trùng - Viện thú y Việt Nam và Trung tâm chẩn đoán thú y - Cục thú y Việt Nam.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Phương pháp tính tỷ lệ và hệ số gia súc mắc bệnh
* Tỷ lệ mắc bệnh và chết trong năm nghiên cứu - Tỷ lệ mắc bệnh chung (TLMBC)
Số động vật mắc bệnh
TLMBC (%) = ×100
Tổng đàn loài động vật đó
Thời kỳ là 1 tháng, 1 năm, 5 năm, 10 năm tùy theo năm nghiên cứu
- Tỷ lệ mắc bệnh ở đàn đe dọa
Số con mắc bệnh
TLMB (%)= ×100
Tổng đàn bị đe dọa
Tổng đàn đe dọa là tổng số vật nuôi trong phạm vi xã, huyện, tỉnh ở cùng thời kỳ nghiên cứu, kể cả những vật nuôi không mắc bệnh của vùng nghiên cứu nằm trong vùng chịu ảnh hưởng của dịch.
- Tỷ lệ chết/tổng đàn (tỷ lệ chết - TLC) Số trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng TLC (%) = ×100 Tổng đàn trâu bò - Tỷ lệ chết/số ốm (tỷ lệ tử vong - TLTV) Số trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng TLTV (%) = ×100
* Phƣơng pháp lấy mẫu: Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe
Dùng que đầu quấn bông thấm đã được hấp vô trùng ngoáy sâu vào mũi trâu, bò để thấm dịch tiết, cho que bông vào ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0,9% đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi nhãn, đánh số thứ tự rồi đưa về phòng thí nghiệm (mẫu được cho vào phích lạnh khi vận chuyển). Sau khi mang về phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 40
C.
Bệnh phẩm: Lấy mẫu máu tim, gan, tủy xương trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng, được bảo quản lạnh đem về phòng thí nghiệm.
* Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập
Mẫu bệnh phẩm được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, MacConkey, bồi dưỡng ở 370
C trong 24 giờ. Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chon lọc để thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi khuẩn. Khuẩn lạc của P. multocida được xác định theo tiêu chuẩn của Hedleston và cs (1966) [56]
2.3.2.2. Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của P. multocida
* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhuộm Gram
- Cố định tiêu bản: Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dung que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh lý. Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm: Nhỏ một giọt tím tinh thể (crystian violet) để 1 phút, cố định màu bằng dung dịch lugol, để 1 phút, rửa nhanh bằng nước cất. Nhuộm lại tiêu bản bằng dung dịch đỏ fucxin, để 2 phút. Rửa nhanh bằng nước cất, để khô tự nhiên.
- Kiểm tra dưới kính hiển vi: Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, sử dung vật kính dầu, kiểm tra hình thái vi khuẩn ở độ phóng đại 1000 lần.
* Thử phản ứng Oxydaza
Phenylene. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu chỗ được bôi khuẩn lạc sau 10 giây xuất hiện màu xanh tím là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu xanh tím hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính.
* Thử phản ứng Catalaza
Nhỏ dung dịch lên phiến kính sạch vài giọt dung dịch H2O2 3%, dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc điển hình trộn đều. Sau 5 giây hiện tượng sủi bọt xuất hiện là dương tính, không thay đổi gì là phản ứng âm tính.
* Thử phản ứng phân hủy Urea
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường ure và bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C, sau 4-24 giờ thì đọc kết quả. Nếu dung dịch có màu hồng là dương tính, dung dịch không chuyển màu là âm tính.
* Phản ứng sinh Indol
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào môi trường Nutrient Broth sau đó bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 1-3 giọt Kowac dọc theo thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính xuất hiện một vòng đỏ thẫm trên bề mặt.
* Khả năng lên men đƣờng, khả năng sinh H2S
Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc nghi là vi khuẩn P. multocida
cấy lên môi trường thạch nghiêng TSI.
- Trên bề mặt thạch nghiêng: Xác định độ lên men đường Lactosa, nếu thạch chuyển sang màu đỏ là phản ứng dương tính. Vi khuẩn P. multocida
không lên men đường lactose.
- Trên bề mặt thạch đứng: Xác định độ lên men đường Glucosa, nếu thạch chuyển sang màu vàng là phản ứng dương tính.
multocida
Xác định serotype vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Phản ứng sử dụng cặp mồi (Primer sequences) sau:
KTT72 5’-AGG-CTC-GTT-TGG-ATT-ATG-AAG-3’ KTSP61 5’-ATC-CGC-TAA-CAC-ACT-CTC-3’
Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 94˚C/3phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94˚C/3 phút, ủ bắt cặp 55˚C/1 phút, kéo dài 72˚C/1 phút ) và kéo dài cuối cùng 72˚C/7 phút.
Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ xung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
2.3.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập được
2.3.3.1. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột bạch
Sau khi nuôi cấy và tiến hành thuần khiết vi khuẩn phân lập được qua các môi trường nuôi chọn lọc, cấy chủng vi khuẩn thử lên môi trường BHI, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm.
Sử dụng chuột bạch (18-22g/con) khỏe, mỗi chủng dùng tiêm 2 chuột, liều tiêm xoang bụng 0,2ml/chuột. Theo dõi chuột chết trong 72 giờ và đến hết 7 ngày.
Chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn.
Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
Dị ch ngoáy mũi, mẫu bệnh
phẩm
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida (Quinn P.J.et al (1994) [74])
2.3.3.2. Phương pháp kháng sinh đồ
Các chủng P. multocida phân lập được xác định tính mẫn cảm kháng sinh theo phương pháp của Kirby-Bauer (1980).
Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida thử được cấy vào môi trường BHI và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Lấy 0,5ml canh trùng pha loãng đến hiệu giá 10-4. Dùng pipetman hút 0,2ml canh trùng đã pha
Kiểm tra đ ặc tính sinh vật, hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa
Oxidase (+), Calatase (+), Indole (+)
Thử phản ứng lên men đ ường, khả năng dung
huyết
Thử đ ộc lực Kháng sinh đ ồ Giữ giống
bằng phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
Trâu, bò trong các ổ dịch cũ, lấy máu tĩnh mạch cổ, để đông tự nhiên trong điều kiện vô trùng ở 4-8oC, chắt lấy huyết thanh để xác định hàm lượng kháng thể chủ động tự nhiên đối với bệnh tụ huyết trùng.
Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể P. multocida:
- Gắn kháng nguyên đã biết (P. multocida) lên pha rắn; rửa bằng PBS để loại bỏ kháng nguyên thừa.
- Cho vào giếng phản ứng huyết thanh cần chẩn đoán (có thể có hoặc không có kháng thể nghi P. multocida). Nếu có kháng thể đặc hiệu, tương ứng sẽ xảy ra kết hợp KN-KT, rửa PBS để loại bỏ kháng thể thừa.
- Cho kháng kháng thể tương ứng đã gắn enzym (enzym HRPO), rửa PBS để loại bỏ conjugate thừa.
- Cho cơ chất tương ứng với enzym (cơ chất TMB substrate).
- Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, dừng phản ứng bằng H2SO4.4N. Đọc kết quả bằng quang phổ kế ở bước sóng 650nm.
Trong trường hợp huyết thanh nghi không có kháng thể tương ứng, phức hợp KN-KT sẽ không tạo thành nên không xảy ra bước tiếp theo KT-KKT do phần kháng thể thừa ở bước hai đã bị rửa trôi, cơ chất không có enzym tương ứng phân huỷ nên không tạo màu, quang phổ kế cho kết quả âm tính.
Tương tự như trên đối với các mẫu huyết thanh xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch tại các thời điểm san khi tiêm phòng vắc xin trên cơ sở kiểm tra hàm lượng kháng thể trong mẫu máu trâu, bò thí nghiệm và đối chứng.
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Minitab và máy tính cá nhân với các thông số thống kê. (Chu Văn Mẫn, 2001[19])
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn trên địa bàn tỉnh Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Bằng từ năm 2008 - 2011
Việc xác định số trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng hàng năm, mùa phát bệnh và sự ảnh hưởng của khí hậu thời tiết tới sự phát sinh và lây lan bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Cao Bằng là cơ sở khoa học để chủ động đề ra các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả tiến tới thanh toán bệnh. Để thực hiện được mục đích trên, từ năm 2008 - 20011 dựa trên các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học, quan sát triệu chứng, bệnh tích và các số liệu lưu trữ của Chi cục Thú y, chúng tôi tiến hành điều tra số trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng và chết trên địa bàn tỉnh. Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Thời gian (năm ) Tổng đàn gia
súc (con) Tình hình gia súc mắc bệnh tụ huyết trùng
Trâu bò Lợn Trâu bò Lợn Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) Số mắc bện h (con ) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) 2008 24678 9 311877 815 0.33 455 55.8 2 2063 0.66 673 32.62 23416 47.1
4 9 x X ± m 0.34 7 ± 0.02 6 39.3 9 ± 7.50 0.65 5 ± 0.03 8 24.02 ± 3.78
Từ bảng 3.1, các kết quả thu được cho thấy: Tại Cao Bằng, trong khoảng thời gian này (4 năm), tỷ lệ trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là