4. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
2.3.1.Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Phương pháp tính tỷ lệ và hệ số gia súc mắc bệnh
* Tỷ lệ mắc bệnh và chết trong năm nghiên cứu - Tỷ lệ mắc bệnh chung (TLMBC)
Số động vật mắc bệnh
TLMBC (%) = ×100
Tổng đàn loài động vật đó
Thời kỳ là 1 tháng, 1 năm, 5 năm, 10 năm tùy theo năm nghiên cứu
- Tỷ lệ mắc bệnh ở đàn đe dọa
Số con mắc bệnh
TLMB (%)= ×100
Tổng đàn bị đe dọa
Tổng đàn đe dọa là tổng số vật nuôi trong phạm vi xã, huyện, tỉnh ở cùng thời kỳ nghiên cứu, kể cả những vật nuôi không mắc bệnh của vùng nghiên cứu nằm trong vùng chịu ảnh hưởng của dịch.
- Tỷ lệ chết/tổng đàn (tỷ lệ chết - TLC) Số trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng TLC (%) = ×100 Tổng đàn trâu bò - Tỷ lệ chết/số ốm (tỷ lệ tử vong - TLTV) Số trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng TLTV (%) = ×100
* Phƣơng pháp lấy mẫu: Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe
Dùng que đầu quấn bông thấm đã được hấp vô trùng ngoáy sâu vào mũi trâu, bò để thấm dịch tiết, cho que bông vào ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0,9% đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi nhãn, đánh số thứ tự rồi đưa về phòng thí nghiệm (mẫu được cho vào phích lạnh khi vận chuyển). Sau khi mang về phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 40
C.
Bệnh phẩm: Lấy mẫu máu tim, gan, tủy xương trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng, được bảo quản lạnh đem về phòng thí nghiệm.
* Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập
Mẫu bệnh phẩm được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, MacConkey, bồi dưỡng ở 370
C trong 24 giờ. Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chon lọc để thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi khuẩn. Khuẩn lạc của P. multocida được xác định theo tiêu chuẩn của Hedleston và cs (1966) [56]
2.3.2.2. Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của P. multocida
* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhuộm Gram
- Cố định tiêu bản: Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dung que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh lý. Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm: Nhỏ một giọt tím tinh thể (crystian violet) để 1 phút, cố định màu bằng dung dịch lugol, để 1 phút, rửa nhanh bằng nước cất. Nhuộm lại tiêu bản bằng dung dịch đỏ fucxin, để 2 phút. Rửa nhanh bằng nước cất, để khô tự nhiên.
- Kiểm tra dưới kính hiển vi: Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, sử dung vật kính dầu, kiểm tra hình thái vi khuẩn ở độ phóng đại 1000 lần.
* Thử phản ứng Oxydaza
Phenylene. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu chỗ được bôi khuẩn lạc sau 10 giây xuất hiện màu xanh tím là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu xanh tím hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính.
* Thử phản ứng Catalaza
Nhỏ dung dịch lên phiến kính sạch vài giọt dung dịch H2O2 3%, dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc điển hình trộn đều. Sau 5 giây hiện tượng sủi bọt xuất hiện là dương tính, không thay đổi gì là phản ứng âm tính.
* Thử phản ứng phân hủy Urea
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường ure và bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C, sau 4-24 giờ thì đọc kết quả. Nếu dung dịch có màu hồng là dương tính, dung dịch không chuyển màu là âm tính.
* Phản ứng sinh Indol
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào môi trường Nutrient Broth sau đó bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 1-3 giọt Kowac dọc theo thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính xuất hiện một vòng đỏ thẫm trên bề mặt.
* Khả năng lên men đƣờng, khả năng sinh H2S
Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc nghi là vi khuẩn P. multocida
cấy lên môi trường thạch nghiêng TSI.
- Trên bề mặt thạch nghiêng: Xác định độ lên men đường Lactosa, nếu thạch chuyển sang màu đỏ là phản ứng dương tính. Vi khuẩn P. multocida
không lên men đường lactose.
- Trên bề mặt thạch đứng: Xác định độ lên men đường Glucosa, nếu thạch chuyển sang màu vàng là phản ứng dương tính.
multocida
Xác định serotype vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Phản ứng sử dụng cặp mồi (Primer sequences) sau:
KTT72 5’-AGG-CTC-GTT-TGG-ATT-ATG-AAG-3’ KTSP61 5’-ATC-CGC-TAA-CAC-ACT-CTC-3’
Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 94˚C/3phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94˚C/3 phút, ủ bắt cặp 55˚C/1 phút, kéo dài 72˚C/1 phút ) và kéo dài cuối cùng 72˚C/7 phút.
Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ xung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
2.3.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập được
2.3.3.1. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột bạch
Sau khi nuôi cấy và tiến hành thuần khiết vi khuẩn phân lập được qua các môi trường nuôi chọn lọc, cấy chủng vi khuẩn thử lên môi trường BHI, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm.
Sử dụng chuột bạch (18-22g/con) khỏe, mỗi chủng dùng tiêm 2 chuột, liều tiêm xoang bụng 0,2ml/chuột. Theo dõi chuột chết trong 72 giờ và đến hết 7 ngày.
Chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn.
Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
Dị ch ngoáy mũi, mẫu bệnh
phẩm
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida (Quinn P.J.et al (1994) [74])
2.3.3.2. Phương pháp kháng sinh đồ
Các chủng P. multocida phân lập được xác định tính mẫn cảm kháng sinh theo phương pháp của Kirby-Bauer (1980).
Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida thử được cấy vào môi trường BHI và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Lấy 0,5ml canh trùng pha loãng đến hiệu giá 10-4. Dùng pipetman hút 0,2ml canh trùng đã pha
Kiểm tra đ ặc tính sinh vật, hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa
Oxidase (+), Calatase (+), Indole (+)
Thử phản ứng lên men đ ường, khả năng dung
huyết
Thử đ ộc lực Kháng sinh đ ồ Giữ giống
bằng phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
Trâu, bò trong các ổ dịch cũ, lấy máu tĩnh mạch cổ, để đông tự nhiên trong điều kiện vô trùng ở 4-8oC, chắt lấy huyết thanh để xác định hàm lượng kháng thể chủ động tự nhiên đối với bệnh tụ huyết trùng.
Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể P. multocida:
- Gắn kháng nguyên đã biết (P. multocida) lên pha rắn; rửa bằng PBS để loại bỏ kháng nguyên thừa.
- Cho vào giếng phản ứng huyết thanh cần chẩn đoán (có thể có hoặc không có kháng thể nghi P. multocida). Nếu có kháng thể đặc hiệu, tương ứng sẽ xảy ra kết hợp KN-KT, rửa PBS để loại bỏ kháng thể thừa.
- Cho kháng kháng thể tương ứng đã gắn enzym (enzym HRPO), rửa PBS để loại bỏ conjugate thừa.
- Cho cơ chất tương ứng với enzym (cơ chất TMB substrate).
- Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, dừng phản ứng bằng H2SO4.4N. Đọc kết quả bằng quang phổ kế ở bước sóng 650nm.
Trong trường hợp huyết thanh nghi không có kháng thể tương ứng, phức hợp KN-KT sẽ không tạo thành nên không xảy ra bước tiếp theo KT-KKT do phần kháng thể thừa ở bước hai đã bị rửa trôi, cơ chất không có enzym tương ứng phân huỷ nên không tạo màu, quang phổ kế cho kết quả âm tính.
Tương tự như trên đối với các mẫu huyết thanh xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch tại các thời điểm san khi tiêm phòng vắc xin trên cơ sở kiểm tra hàm lượng kháng thể trong mẫu máu trâu, bò thí nghiệm và đối chứng.
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Minitab và máy tính cá nhân với các thông số thống kê. (Chu Văn Mẫn, 2001[19])
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn trên địa bàn tỉnh Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Bằng từ năm 2008 - 2011
Việc xác định số trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng hàng năm, mùa phát bệnh và sự ảnh hưởng của khí hậu thời tiết tới sự phát sinh và lây lan bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Cao Bằng là cơ sở khoa học để chủ động đề ra các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả tiến tới thanh toán bệnh. Để thực hiện được mục đích trên, từ năm 2008 - 20011 dựa trên các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học, quan sát triệu chứng, bệnh tích và các số liệu lưu trữ của Chi cục Thú y, chúng tôi tiến hành điều tra số trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng và chết trên địa bàn tỉnh. Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 Thời gian (năm ) Tổng đàn gia
súc (con) Tình hình gia súc mắc bệnh tụ huyết trùng
Trâu bò Lợn Trâu bò Lợn Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) Số mắc bện h (con ) Tỷ lệ (%) Số chết (con ) Tỷ lệ chết (%) 2008 24678 9 311877 815 0.33 455 55.8 2 2063 0.66 673 32.62 23416 47.1
4 9 x X ± m 0.34 7 ± 0.02 6 39.3 9 ± 7.50 0.65 5 ± 0.03 8 24.02 ± 3.78
Từ bảng 3.1, các kết quả thu được cho thấy: Tại Cao Bằng, trong khoảng thời gian này (4 năm), tỷ lệ trâu, bò và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là khá cao. Ở trâu, bò đã có (0.347 ± 0.026)% số trâu bò mắc bệnh so với tổng đàn và tỷ lệ chết so với số trâu, bò ốm là (39.39 ± 7.50)%. Ở Lợn tỷ lệ ốm là (0.655 ± 0.038)% và tỷ lệ chết so với ốm là (24.02 ± 3.78).
So với kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Văn Dũng (2000)[3] khi nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Lai Châu (0,63%) và kết quả của Nguyễn Đình Trọng (2002)[36] khi điều tra tại tỉnh Bắc Kạn (0,77%) thì tỷ lệ mắc bệnh ở trâu, bò mà chúng tôi điều tra thấp hơn, song kết quả này lại cao hơn kết quả của Cao Văn Hồng (2002)[9] điều tra ở Đắk Lắk (0,18%). Ở lợn thì kết quả điều tra của chúng tôi thấp hơn so với kết quả điều tra của tác giả Đỗ Quốc Tuấn (2008)[37] ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam là 3,54%. Có sự khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh của các tỉnh nói trên có thể lý giải do tập quán chăn nuôi ở mỗi vùng miền khác nhau nên tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau. Ở Lai Châu, Cao Bằng, Bắc Kạn và một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam trâu, bò được nuôi với mục đích chủ yếu là để sử dụng sức kéo cho nông nghiệp và vận chuyển do đó thường gặp các yếu tố stress do ảnh hưởng của sự thay đổi thời tiết, do áp lực của công tác cày kéo nặng nề của mùa vụ, còn ở Đắk Lắk trâu, bò được nuôi với mục đích lấy thịt do vậy mà tỷ lệ mắc bệnh ở đây thấp hơn.
Trong 4 năm điều tra (từ năm 2008 đến năm 2011) chúng tôi thấy tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu bò giao động từ 0.28% đến 0.40%. Năm 2009 đàn trâu bò có tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng cao nhất trong các năm
điều tra. Nguyên nhân chủ yếu là do do mùa đông năm 2009 tỉnh Cao Bằng là khu vực chịu ảnh hưởng mạnh của đợt rét đậm rét hại kéo dài. Trâu, bò vừa bị rét vừa thiếu thức ăn nên tạo điều kiện cho dịch bệnh tụ huyết trùng lan rộng gây thiệt hại lớn.
Qua các số liệu trên cho thấy bệnh tụ huyết trùng xảy ra trên địa bàn tỉnh Cao Bằng khá phổ biến và vẫn là mối đe doạ cho ngành chăn nuôi của tỉnh.
3.1.2. Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ năm 2008 đến năm 2011 năm 2008 đến năm 2011
Mỗi loài gia súc khác nhau có mức độ cảm nhiễm bệnh khác nhau. Để so sánh mức độ cảm nhiễm bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu và đàn bò, chúng tôi tiến hành điều tra số con mắc bệnh tụ huyết trùng và số con chết do mắc bệnh tụ huyết trùng qua bốn năm, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ năm 2008 đến năm 2011 Loài Năm Trâu Bò Số theo dõi (con) Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Số con chết (con) Tỷ lệ chết (%) Số theo dõi (con) Số mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Số con chết (con) Tỷ lệ chết (%) 2008 132992 487 0.36 307 63.04 113792 328 0.28 148 45.12 2009 131079 591 0.45 323 54.65 103088 360 0.34 165 45.83 2010 130067 428 0.32 156 36.44 109008 257 0.24 67 26.07 2011 131508 587 0.44 152 25.89 110596 332 0.30 51 15.36 Tính chung 525646 2093 0.40 938 44.82 436484 1277 0.29 431 33.75
Qua bảng 3.2 ta thấy: tỷ lệ mắc bệnh của đàn trâu qua 4 năm trung bình là 0.40% trên tổng số đàn. Tỷ lệ này thấp nhất là vào năm 2010 với 0.32% và cao nhất là vào năm 2009 với 0.45%. Tỷ lệ mắc bệnh của bò qua bốn năm điều tra bình quân là 0.29%, thấp nhất là năm 2010 với 0.24% và cao nhất là năm 2009 với 0.34%. So sánh tỷ lệ mắc tính chung qua bốn năm giữa hai đàn trâu bò ta thấy ràng đàn trâu có tỷ lệ mắc cao hơn so với đàn bò. Với độ tin cậy P1 = 0.042<0.05 ta có thể khẳng định sự khác biệt này là rõ rệt.
Tỷ lệ chết so với ốm của đàn trâu qua bốn năm là 44.82%, của đàn bò là 33.75%. Đây là một tỷ lệ chết khá cao. Tuy nhiên ta có thể thấy tỷ lệ chết của đàn trâu đang giảm dần, từ năm 2008 là 63.04% thì tới năm 2011 chỉ còn 25.89%, tương tự ở bò, tỷ lệ chết năm 2008 là 45.12% thì năm 2011 chỉ còn 15.36%. Tỷ lệ chết của đàn trâu bò đều giảm qua các năm có thể do kỹ thuật chẩn đoán, điều trị bệnh của cán bộ thú y cơ sở ngày một năng cao, hơn nữa những năm gần đây, chi cục thú y Cao Bằng luôn quan tâm tới vấn đề tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng cho đàn gia súc nên mặc dù dịch có xảy ra, song mức độ thiệt hại về đầu con đã được khống chế đáng kể. So sánh tỷ lệ chết của đàn trâu và đàn bò do tụ huyết trùng gây ra qua các năm ta thấy sự sai khác nhau giữa hai đàn không có ý nghĩa (P2 = 0.34>0.05).
Kết quả điều tra của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của tác giả De Alwis (1984)[49]:loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu và bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò.
Như vậy tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của trâu bò tại Cao Bằng khá phức tạp. Tỷ lệ mắc bệnh của đàn trâu luôn luôn cao hơn đàn bò, tuy nhiên tỷ lệ chết giữa hai đàn không khác nhau nhiều.
3.1.3. Tần suất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại các huyện từ năm 2008 - 2011 2008 - 2011
Theo nhiều tác giả thì bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là một bệnh có tính địa phương rất đặc trưng. Vì vậy việc xác định tần số xuất hiện dịch tụ huyết