Bƣớc thứ hai của cụng nghệ cấy truyền phụi là tiến hành thu phụi ở bũ GRTN. Để làm điều này ngƣời ta chủ động thụ tinh cho bũ cỏi GRTN rồi thu lấy số phụi hỡnh thành trong sự thụ tinh giữa tinh trựng với cỏc tế bào trứng đó rụng.
Ngƣời ta cũng cú thể thu cỏc tế bào trứng rụng và cho thụ tinh ống nghiệm để tạo phụi trong ống nghiệm.
Tới một sự phỏt triển nhất định của phụi (hợp tử) thỡ ta tiến hành phõn loại phụi để lựa chọn cỏc phụi đủ tiờu chuẩn đƣa đi cấy vào tử cung cho con cỏi nhận hoặc đƣa vào bảo quản ở điều kiện tiềm sinh để giữ phụi lõu dài, cũn gọi là sự đụng lạnh phụi. Nhƣ vậy, đỏnh giỏ phõn loại phụi là bƣớc giỏm định chất lƣợng trƣớc khi sử dụng (cấy phụi tƣơi hay đụng lạnh phụi) trong cụng nghệ phụi. a. Cơ sở đỏnh giỏ phõn loại phụi
- Hỡnh thỏi chung của phụi: Phụi cú hỡnh dỏng nhƣ hỡnh cầu dẹt, nhỡn qua kớnh hiển vi cú hỡnh trũn, đƣợc giới hạn bởi màng trong suốt. Kớch thƣớc của phụi từ 100-200μm.
- Mức độ phõn chia tế bào: Số lƣợng tế bào này phụ thuộc vào giai đoạn phỏt triển. Đầu tiờn là một tế bào rồi 2, 4, 8, 16 tế bào, phụi dõu, phụi nang.
- Màu sắc của phụi: Màu sắc cú liờn quan đến mức độ phỏt triển, sống, chết hay thoỏi húa của cỏc tế bào, mức độ tập trung hay phõn tỏn của mầm phụi, mức độ tổn thƣơng của cỏc tế bào.
b. Phƣơng phỏp phõn loại phụi theo Linder and Wright (1983) [76]
Phụi sau khi thu hoạch phụi đƣợc đỏnh giỏ và phõn loại dựa theo cỏc chỉ tiờu: - Trứng khụng thụ tinh: Nhõn trứng cú cấu trỳc đồng nhất, khụng cú sự phõn húa tế bào.
- Trứng thụ tinh: Nhõn trứng cú sự phõn húa tế bào và tƣơng ứng với cỏc giai đoạn phỏt triển của phụi và đƣợc phõn loại nhƣ sau:
+ Phụi kộm chất lƣợng: là những phụi chậm phỏt triển, phụi thoỏi húa hoặc là phụi chết.
+ Phụi chất lƣợng tốt: là những phụi cú hỡnh dỏng và kớch thƣớc bỡnh thƣờng, số lƣợng phụi bào phỏt triển phự hợp với tuổi của phụi, màu sắc của tế bào đặc trƣng.
Phụi kộm chất lƣợng hoặc phụi chết, đều khụng đƣợc sử dụng trong cụng nghệ cấy phụi.
Những phụi chất lƣợng tốt đƣợc sử dụng trong cụng nghệ cấy phụi và đƣợc đỏnh giỏ, phõn loại nhƣ sau:
* Phõn loại phụi theo giai đoạn phỏt triển
- Phụi dõu (Morula): phụi phỏt triển ngày thứ 5-6, cú trờn 16 tế bào, cỏc phụi bào liờn kết chặt chẽ với nhau tạo thành một khối ớt cú tế bào tỏch rời, biờn giới giữa cỏc phụi bào rất rừ.
- Phụi nang sớm (Early Blastocyst): Đú là phụi đó hỡnh thành nờn một khoảng trống chứa đầy dịch (gọi là xoang phụi). Xoang phụi chiếm khoảng 20-30 % diện tớch khối tế bào.
- Phụi nang (Blastocyst): là phụi cú xoang đó lớn chiếm khoảng 50% diện tớch khối tế bào và đẩy ộp khối tế bào về một cực, màng nuụi lớn dần tiến sỏt về phớa màng trong suốt.
* Phõn loại phụi theo chất lượng phụi
Cỏc loại phụi dõu, phụi nang ở cỏc giai đoạn phỏt triển khỏc nhau đƣợc đỏnh giỏ theo chất lƣợng sau:
- Loại rất tốt - loại A: Phụi cú hỡnh thỏi đỳng với giai đoạn phỏt triển chung. Màng trong suốt trũn đẹp và sỏng. Khối tế bào đậm, phõn chia đều, rừ
nột. Cỏc phụi bào liờn kết với nhau chặt chẽ, khụng cú tế bào rời hoặc mảnh vụn bờn ngoài.
- Loại tốt - loại B: Phụi cú hỡnh dỏng kớch thƣớc tốt, phản ỏnh đỳng giai đoạn phỏt triển, nhƣng khối tế bào khụng đẹp, khụng đều, khụng rừ nột nhƣ loại A. Sự liờn kết của cỏc tế bào tƣơng đối chặt, đụi khi cú mảnh vụn tế bào hoặc tế bào rời.
- Loại trung bỡnh - loại C: Phụi cú màu sắc phõn bố khụng đồng đều, cỏc tế bào liờn kết lỏng lẻo, nhiều tế bào rời nhiều mảnh vụn xen kẽ hoặc tụ thành đỏm nhỏ. Kớch thƣớc tế bào nhỏ hơn bỡnh thƣờng. Màng trong suốt cú thể cũn nguyờn vẹn nhƣng nhỏ hoặc khụng trũn.
- Loại kộm - loại D: Phụi phỏt triển chậm so với tuổi, cỏc tế bào phụi bị vỡ, màng trong suốt bị khuyết tật, cú hỡnh dỏng và kớch thƣớc khụng bỡnh thƣờng hoặc phụi bị thoỏi húa.
Cỏc phụi loại A, B là loại cú thể cấy ngay hoặc đụng lạnh để bảo quản dự trữ, loại C cú thể cấy truyền ngay (cấy phụi tƣơi) nhƣng khụng thể đụng lạnh đƣợc, loại D khụng dựng để cấy cũng nhƣ đụng lạnh.