Nuôi cấy tế bào huyền phù Tạo callus
Nhân callus Cây cà gai leo in vitro
Thăm dị nồng độ chất kích kháng (YE và MeJA) Thăm dị thời điểm bổ sung chất kích kháng (YE và MeJA)
Thu sinh khối tế bào
Định lượng Tách chiết solasodine
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là cây cà gai leo in vitro (Solanum
hainanense Hance) [10] thuộc họ Cà (Solanaceae).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm của chúng tơi được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp của Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Tạo callus từ các bộ phận khác nhau của cây cà gai leo in vitro trên mơi trường cơ bản MS có 30 g/L saccharose, 8 g/L agar, bổ sung 0,1 mg/L NAA và 1,0 mg/L 2,4-D [1 ].
Callus sơ cấp 3 tuần tuổi được cắt thành những khối nhỏ đường kính 0,5 cm (khoảng 0,2 g) để cấy chuyển trên cùng môi trường nhưng thay 0,1 mg/L NAA bằng 0,1 mg/L BAP [34].
2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù
2.2.2.1. Thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù
Nghiền nhỏ 3 g nguyên liệu callus chuyển vào bình tam giác 250 mL chứa 50 mL mơi trường MS lỏng có 30 g/L saccharose, bổ sung 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D. Tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sau 3 tuần nuôi cấy, tế bào được chuyển sang mơi trường mới có thành phần giống mơi trường ban đầu và nuôi trong cùng một điều kiện cho đến khi thu được dịch tế bào huyền phù đồng nhất.
Tế bào sau 3 tuần nuôi cấy tăng sinh được sử dụng cho các thí nghiệm thăm dò nồng độ và thời điểm bổ sung chất kích kháng. Mỗi lần cấy chuyển lấy 20 mL dịch tế bào huyền phù chuyển vào bình môi trường mới [34].
2.2.2.2. Thăm dò ảnh hưởng của chất kích kháng thực vật lên khả năng sinhtrưởng và tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo trưởng và tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo
Chuyển 20 mL tế bào huyền phù 3 tuần tuổi vào bình tam giác 250 mL chứa 50 mL mơi trường MS lỏng có 40 g/L saccharose, bổ sung 1,0 mg/L BAP, 1,0 mg/L 2,4-D. Tốc độ lắc 150 vòng/phút [34].
Methyl jasmonate và dịch chiết nấm men được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào với các nồng độ tương ứng là 50-300 µM và 1-4 g/L các thời điểm khác nhau từ 0, 1 và 3 tuần.
Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử trùng môi trường ở 121oC, trong 15 phút. Các thí nghiệm ni cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25±2oC, điều kiện chiếu sáng 2000-3000 lux (đối với callus) và 500 lux (đối với tế bào huyền phù), thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày.
2.2.3. Xác định sinh khối tế bào
- Khối lượng tươi: Tế bào được lọc bằng giấy lọc, rửa sạch môi trường bằng
nước cất, cân để xác định khối lượng tươi.
- Khối lượng khô: Sấy khô tế bào ở 50oC trong khoảng 24 giờ cho đến khi khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô.
2.2.4. Tách chiết solasodine: phương pháp Soxhlet [16]
Mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi và nghiền thành bột mịn. Cân 1 g mẫu, chiết trên cách thủy sinh hàn ngược với 50 mL dung dịch acetic acid 5% trong methanol trong 3 giờ. Lọc, cô dịch chiết trong chân không ở 50oC. Hòa tan kết tủa bằng methanol, lọc và chuyển vào bình định mức 10 mL. Tráng nhiều lần bằng methanol và thêm methanol đến vạch.
2.2.5. Định lượng solasodine bằng HPLC
Định lượng solasodine bằng cách so sánh trực tiếp chiều cao hay diện tích peak (đỉnh) của mẫu nghiên cứu với chiều cao hay diện tích peak của mẫu chuẩn có nồng độ xác định (0,5 mg/mL). Yêu cầu của phương pháp này là mẫu thử và mẫu chuẩn phải tiến hành trong cùng điều kiện sắc ký và về nguyên tắc thời gian thực hiện hai mẫu không được cách xa nhau. Ngoài ra, nồng độ của mẫu thử phải nằm trong khoảng tỷ lệ tuyến tính của nồng độ chất chuẩn và các dữ liệu HPLC (chiều cao hay diện tích peak) thu được.
Hóa chất dùng trong HPLC
- Methanol dùng cho HPLC (Merck, Đức) - Dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo
Dịch chiết solasodine từ tế bào cà gai leo được lọc bằng màng lọc Minisart 0,45 µm (Sartorius, Đức) để loại tạp bẩn, pha loãng dịch chiết 5 lần trong methanol và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Tiến hành
- Xác định điều kiện và thơng số kỹ thuật thích hợp: sử dụng phương pháp của Thongchai và cs (2005) [57] có cải tiến, chúng tơi chọn các điều kiện và thông số thích hợp nhất để chạy HPLC như sau:
+ Cột Lichrospher 18e ( 250 x 4 mm, 5µm) - Merck + Pha động: methanol
+ Tốc độ dòng: 1 mL/phút + Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
+ Detector phát hiện ở bước sóng 254 nm + Thời gian chạy cho một mẫu: 25 phút
Mẫu được phân tích trên hệ thống HPLC Shimadzu LC 20A với bơm LC- 20AD, đầu dò SPD-20A, bộ bơm mẫu tự động SIL-20A HT và sử dụng phần mềm LC Solution 1.22
Hàm lượng solasodine trong dịch chiết (mg/g) (X) được tính theo cơng thức: 10 5× × × = A S S X AS M
Trong đó: SAS: diện tích peak của solasodine chuẩn, SM: diện tích peak của solasodine trong mẫu, A: nồng độ mẫu chuẩn (mg/mL), 5: hệ số pha loãng của mẫu khi chạy HPLC, 10: 1 g mẫu chiết được 10 mL.
2.2.6. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm trung bình được lặp lại 3 lần. Các số liệu thực nghiệm được tính trung bình mẫu và sai số chuẩn bằng chương trình Microsoft Excel và phân tích Duncan’s test (p<0,05) bằng chương trình The SAS System (ver. 6.12).