Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NUÔI CẤY TẾ BÀO
3.3.2. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung dịch chiết nấm men
Dựa trên kết quả được trình bày ở bảng 3.6, chúng tôi chọn YE 3 g/L để tiến hành thăm dò ảnh hưởng của thời điểm bổ sung kích kháng lên khả năng tích lũy solasodine. Các thời điểm bổ sung kích kháng là từ lúc bắt đầu nuôi cấy, sau 1 tuần và 3 tuần nuôi cấy.
3.3.2.1. Sinh trưởng của tế bào
Khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo sau 4 tuần ni cấy có bổ sung 3 g/L YE tại các thời điểm khác nhau được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung YE lên sinh trưởng tế bào Thời điểm
(tuần)
Khối lượng tế bào (g)
Tươi Khô
0 8,80a 0,48a
1 8,79a 0,45b
3 5,66b 0,35c
ĐC 4,98c 0,45b
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.7 cho thấy sinh khối thu được tại các thời điểm bổ sung YE đều cao hơn so với đối chứng. Sinh khối tươi đạt cao nhất khi bổ sung ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy (8,80 g khối lượng tươi, 0,48 g khối lượng khô), thấp nhất khi bổ sung sau 3 tuần nuôi cấy (5,66 g khối lượng tươi, 0,35 g khối lượng khô). Như vậy, thời điểm bổ sung YE ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào cà gai leo. Thời gian tiếp xúc với chất kích kháng càng lâu thì sinh khối càng tăng. Điều này có thể là do dịch chiết nấm men cũng có khả năng kích thích sinh trưởng của tế bào cà gai leo. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi trình bày ở bảng 3.5.
3.3.2.2. Khả năng tích lũy solasodine
Dịch chiết tế bào được phân tích HPLC để nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm bổ sung YE lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và các hình 3.13, 3.15 và 3.16.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0RT RT 2.0 2 RT 2.1 72 RT 2.5 6 RT 4.6 7
Thời gian lưu (phút)
5000025000 25000 0 Đ ộ h ấp th ụ q ua ng (µ V)
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung YE lên khả năng tích lũy solasodine của tế bào
Thời điểm (tuần)
Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (µV)2 Hàm lượng solasodine (mg/g) 0 2,55 1063376 141,16 1 2,56 815553 108,26 3 2,55 539020 71,55 ĐC 2,57 350742 46,56 Rễ cây tự nhiên 2,60 62768 8,33
Phân tích HPLC solasodine của dịch chiết tế bào cà gai leo nuôi cấy trong môi trường bổ sung YE ở các thời điểm khác nhau cho thấy tất cả các phổ sắc ký đều có peak giống nhau gồm 1 peak chính ở thời gian lưu khoảng 2,6 phút, gần trùng với peak solasodine trong rễ cây cà gai leo tự nhiên và một số peak ở thời gian lưu khác có chiều cao thấp hơn. Các peak này chỉ khác nhau về chiều cao ở các thời điểm bổ sung YE, cao nhất khi bổ sung ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy. Như vậy, thời điểm bổ sung YE ảnh hưởng đến khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo (Hình 3.13, 3.15 và 3.16).
Bảng 3.8 cho thấy hàm lượng solasodine tích lũy trong tế bào ni cấy trên môi trường bổ sung 3 g/L YE ở các thời điểm khác nhau có sự chênh lệch đáng kể. Trong đó, hàm lượng solasodine của tế bào được ni cấy trên mơi trường có bổ sung YE ngay lúc đầu của quá trình nuôi cấy là cao nhất, đạt 141,16 mg/g khối lượng khô, cao gấp khoảng 3 lần so với đối chứng. Nguyên nhân có thể là do thời gian tiếp xúc với chất kích kháng lâu sẽ tăng khả năng tích lũy hợp chất thứ cấp. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của thời điểm bổ sung MeJA.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
Thời gian lưu (phút)
4000030000 30000 20000 10000 0 Đ ộ h ấp th ụ q ua ng (µ V) RT 2.0 2 RT 4.6 7
Hình 3.15. Phổ HPLC của dịch chiết solasodine từ tế bào nuôi cấy trên môi trường
bổ sung YE sau 1 tuần nuôi cấy
Hình 3.16. Phổ HPLC của dịch chiết solasodine từ tế bào nuôi cấy trên mơi trường
bổ sung YE sau 3 tuần ni cấy
Tóm lại, qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy nồng độ và thời điểm bổ sung YE cũng có ảnh hưởng đến sinh khối và khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo. YE ngoài tác dụng làm tăng khả năng tích lũy solasodine còn có thể làm tăng sinh khối tế bào cà gai leo. YE ở nồng độ 3 g/L, bổ sung ngay lúc đầu của
RT2.55 .55
quá trình nuôi cấy cho hàm lượng solasodine cao nhất (đạt 141,16 mg/g khối lượng khô), cao gấp 3 lần so với đối chứng và gấp 17 lần so với rễ cây tự nhiên.
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy nồng độ và thời điểm bổ sung MeJA và YE đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tích lũy solaosdine của tế bào cà gai leo.
- MeJA có tác dụng ức chế sinh trưởng của tế bào cà gai leo, nồng độ càng cao thì sinh khối tế bào thu được càng thấp. Trong khi đó, YE lại có khả năng tăng cường sinh trưởng của tế bào; tuy nhiên, sinh khối tế bào lại tỷ lệ nghịch với nồng độ YE.
- Cả YE và MeJA đều ảnh hưởng đến khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo, khi bổ sung với nồng độ thích hợp sẽ làm tăng hàm lượng solasodine tích lũy trong tế bào. Nồng độ của YE và MeJA tối ưu nhất là 3 g/L và 250 µM, cho hàm lượng solasodine tương ứng là 141,16 và 127,31 mg/g khối lượng khô.
- Thời điểm bổ sung YE và MeJA đều có ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào cà gai leo. Đối với YE, thời điểm bổ sung càng muộn thì sinh khối tế bào thu được càng thấp. Trong khi đó, thời điểm bổ sung MeJA càng muộn thì sinh khối thu được càng cao.
- Thời điểm bổ sung YE và MeJA cũng ảnh hưởng đến khả năng tích lũy solasodine của tế bào cà gai leo. Đối với YE, hàm lượng solasodine thu được cao nhất khi bổ sung ngay từ đầu của q trình ni cấy. Trong khi đó, MeJA cho hàm lượng solasodine cao nhất khi được bổ sung sau 1 tuần nuôi cấy.
Những kết quả trên cho thấy việc bổ sung chất kích kháng vào q trình ni cấy tế bào cà gai leo đã giúp cải thiện khả năng tích lũy solasodine trong tế bào. Như vậy, bằng phương pháp này có thể sản xuất một lượng lớn solasodine trong thời gian ngắn thay vì phải thu từ cây tự nhiên lâu năm.