Bố trắ thắ nghiệm
TT Gia súc Số lượng Tháng tuổi
1 Trâu 5 24 Ờ 36 2 Bò 13 24 Ờ 36 3 Bê 9 7 Ờ 10 4 Nghé 3 7 - 10 Lợn ựực giống 10 Lợn nái 10 5 Lợn Lợn con 10 2 - 3
- Trước khi tiêm thắ ựiểm vacxin phòng bệnh LMLM type O chủng Myanmar 98, trâu, bò, bê, nghé và lợn ựược lấy máu ựể xét nghiệm xem trong cơ thể gia súc ựã có kháng thể chống virus LMLM.
- Sau khi tiêm thử nghiệm vacxin LMLM type O chủng Myanmar 98 ựược 21 ngày, chúng tôi tiến hành lấy máu xét nghiệm hàm lượng kháng thể kháng virus LMLM. Nếu có mức hiệu giá kháng thể từ 1/128 trở ựi ựược coi là ựạt mức bảo hộ. Trường hợp chưa ựạt mức bảo hộ phải tiêm lại vacxin lần hai, sau 21 ngày lấy máu, xét nghiệm hàm lượng kháng thể chống virus LMLM.
* Xác ựịnh hiệu giá kháng thể virus Lở Mồm Long Móng các type O bằng phương pháp ELISA
3.5.2.1. Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
Cố ựịnh gia súc trong gióng giá, cắt lông, sát trùng tĩnh mạch cổ (trâu, bò) hoặc tai (lợn - tại vị trắ lấy máu). Có thể lấy máu theo cách sau:
- Lầy bằng bơm tiêm: đưa mũi kim vào tĩnh mạch cổ (tai), hút 3-5 ml máu, cho vào ống nghiệm 10 ml vô trùng ựã chuẩn bị sẵn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- Lấy bằng kim 2 ựầu và ống chân không: Vặn chặt kim 2 ựầu vào giá ựỡ kim, ựưa ống chân không vào trong giá ựỡ kim và ấn mạnh cho kim xuyên vào nắp cao su của ống. Lưu ý chỉ ựâm kim vào tới ơ nắp cao su ựể không làm mất chân không trong ống. đưa mũi kim vào tĩnh mạch cổ (tai), ựồng thời ấn mạnh ống chân không cho kim xuyên vào bên trong ống. điều chỉnh phần mũi kim ựi vào trong lòng tĩnh mạch, áp suất do chân không trong ống sẽ tự hút máu vào ống.
đặt ống máu nghiêng một góc 450 ở nhiệt ựộ phòng khoảng 2 tiếng ựồng hồ ựể cố ựịnh cho máu ựông. Bảo quản ống máu ở nhiệt ựộ mát (40C) và chuyển ựến phòng xét nghiệm.
- Cách chắt huyết thanh: Ly tâm các ống máu ở tốc ựộ 1500 vòng/phút trong 10 phút, sau ựó chắt huyết thanh cho vào ống nhựa eppendorf 2ml, có nắp, vô trùng ựã chuẩn bị sẵn.
- Bảo quản mẫu huyết thanh ở ngăn mát tủ lạnh. Trong trường hợp ựể lâu, bảo quản huyết thanh ở Ờ200C và tránh lấy huyết thanh ra khỏi tủ lạnh nhiều lần do hiện tượng ựông tan sẽ làm giảm hiệu giá kháng thể.
3.5.2.2. Phương pháp xét nghiệm
Tất cả các mẫu huyết thanh ựược xét nghiệm ựể:
- Xác ựịnh sự có mặt của virus LMLM bằng phản ứng RT- PCR
- Xác ựịnh hàm lượng kháng thể bằng phản ứng LPB-ELISA với hiệu giá 1/128 ựạt mức ựộ bảo hộ.
3.5.2.3. Tiến hành
* Phương pháp RT-PCR
* Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn ựoán RT-PCR và các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thắ nghiệm.
* Các bước tiến hành xét nghiệm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
- Công thức pha áp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hãng Qiagen (nếu dùng kit khác có thể phải thay ựổi công thức pha)
Nguyên liệu Thể tắch (ộộộộl) H2O 12,0 5X Buffer 5,0 dNTP 1,0 Enzyme mix 1,0 Primer forward 0,5 Primer reverse 0,5 Mẫu ARN 5,0 Tổng cộng 25,0
Primer Chiều Chuỗi (5Ỗ Ờ 3Ỗ) Kắch thước
(bp) 1R Reverse CCA GTC CCC TTC TCA
GAT C FMDV- Uni 1F Forward GCC TGG TCT TTC CAG GTC 328
- Chu trình nhân gien:
Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt ựộ
Bước 1 1 chu kỳ 45 phút 370C
Bước 2 1 chu kỳ 10 phút 940C
1 chu kỳ 5 phút 940C
1 phút 940C
1 phút 550C
Bước 3
30 chu kỳ
1 phút 720C
Bước 4 1 chu kỳ 8 phút 720C
Bước 5 1 chu kỳ ∞ 40C
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
- Chạy ựiện di:
+ Chuẩn bị thạch Agarose 2% pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có Ethidium Bromide (10 ộg/ộl ).
+ đổ thạch vào khuôn ựiện di (có lược).
+ Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 ộl sản phẩm PCR + 2 ộl dung dịch loading buffer).
+ Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100 bp).
+ Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu ựối chứng dương và ựối chứng âm ựi kèm (mẫu ựối chứng âm có thể là nước cất sạch).
- đọc kết quả:
+ Mẫu dương tắnh: Xuất hiện vạch và có kắch thước bằng kắch thước giống mẫu ựối chứng dương
+ Mẫu âm tắnh: Không có vạch.
đánh gắa kết quả: Có virus Lở Mồm Long Móng ở trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tắnh.
* Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng LPB ELISA
Nguyên liệu phản ứng gồm có kháng thể bẫy (trapping antibodies); kháng thể phát hiện (detecting antibodies); kháng nguyên; conjugate (kháng huyết thanh thỏ kháng chuột lang ựược cộng hợp với enzim Horseradish peroxidase, conjugate ựược block với huyết thanh bò không có miễn dịch theo tỷ lệ 50% v/v); substrate (H2O2); chất phát màu (chromogen): OPD - Ortho Phenylenediamine; dung dịch ngừng phản ứng: H2SO4 1,25 M; dung dịch ựệm ựể gắn kháng huyết thanh thỏ kháng virus LMLM (coating buffer): Dung dịch ựệm cacbonat/bicacbonat pH: 9,5; dung dịch ựệm pha loãng huyết thanh và kháng nguyên (PBST): dung dịch ựệm PBS 0,01M bổ sung 0,5% Tween
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
20 và phenol red 1%, pH=7,4-7,6; dung dịch ựệm block pha kháng huyết thanh chuột lang và conjugate: dung dịch PBST bổ sung 5% sữa tách bơ (skimmed milk), pH=7,4-7,6; dung dịch rửa: dung dịch ựệm PBS 0,002M, pH = 7,4-7,6; dung dịch ựệm Citrate acetate 1M, pH=5,6 ựể pha dung dịch phát màu; ựĩa ELISA; ựĩa nhựa ựáy chữ U 96 giếng.
* Các bước tiến hành
- Gắn ựĩa: hấp thụ kháng thể thỏ kháng virus LMLM ựược pha loãng theo tỷ lệ 1:1000 với coating buffer. Nhỏ vào mỗi giếng trong ựĩa 96 giếng 50 ộl kháng huyết thanh thỏ ựã pha loãng. đậy nắp và ựể qua ựêm ở nhiệt ựộ 40C (hoặc ở 370C trong 1h)
- Pha lỏng (liquid phase): ựây thực chất là pha trung hòa huyết thanh + Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo cơ số 2 trên ựĩa 96 giếng ựáy chữ U, bắt ựầu từ ựộ pha loãng 1/16 ựến 1/256, Mỗi giếng 50 ộl.
+ Pha loãng kháng nguyên virus LMLM (theo nồng ựộ tối ưu ựã biết hoặc ựã chuẩn ựộ trước khi làm LP- ELISA). Nhỏ 50 ộl kháng nguyên ựã pha loãng vào tất cả các giếng của ựĩa chữ U. đậy nắp ựĩa, ựể ở nhiệt ựộ 40C qua ựêm, trong mỗi ựĩa ựều có ựối chứng dương tắnh mạnh, ựối chứng dương tắnh yếu, ựối chứng âm tắnh và ựối chứng kháng nguyên Ca (không có huyết thanh, chỉ có kháng nguyên và PBST).
+ Chuyển hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên tới ựĩa ELISA: rửa ựĩa phản ứng ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa. Sau khi rửa ựĩa, chuyển 50 ộl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ ựĩa ựáy chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trắ tương ứng.
+ Nhỏ kháng thể phát hiện: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi giếng của ựĩa ELISA 50 ộl kháng huyết thanh chuột lang kháng virus LMLM ựã ựược pha loãng với tỷ lệ 1/100 bằng PBST bổ sung sữa tách bơ. đậy ựĩa, ủ ở nhiệt ựộ 370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
+ Nhỏ conjugate: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl conjugate ựã pha loãng 1/200, đậy ựĩa, ủ ở nhiệt ựộ 370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
+ Thêm Substrate/chromogen: Rửa ựĩa 3 lần, chuẩn bị dung dịch Substrate/chromogen (dung dịch OPD trong citrate acetate buffer bổ sung 0,5% H2O2), nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl, ựể phản ứng xảy ra trong 20-30 phút ở chỗ tối tại nhiệt ựộ phòng (nếu ựể quá lâu hoặc ựể ra chỗ có ánh sáng màu sẽ xuất hiện nhanh và làm sai lệch kết quả).
+ Ngừng phản ứng: Nhỏ vào mỗi giếng 50 ộl dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 1,25M.
+ đọc kết quả: Sử dụng máy ựọc ELISA (photo meter, Lab system Multiscan Plus II) ở bước sóng 492 nm.
- Tắnh kết quả: Từ kết quả ựọc ựược ở máy ta có ựậm ựộ quang học OD (optical density) của mẫu huyết thanh. Từ OD ta tắnh ựược phần trăm ức chế của mẫu PI (percentage inhibition). Dựa vào PI ựể ựánh giá kết quả
Công thức tắnh PI như sau:
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là dương tắnh, kết luận trong kiểm tra có kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ựược coi là âm tắnh, kết
luận trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể LMLM.
* Chú ý: Xác ựịnh hiệu giá kháng thể, mẫu huyết thanh ựược pha như sau: - Huyết thanh kiểm tra, pha loãng 1:8
- Nhỏ dung dịch buffer A: 50 ộl/giếng vào các lỗ của ựĩa chữ U bắt ựầu từ cột 3 cho ựến cột 12 của tất cả các hàng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
- Nhỏ huyết thanh kiểm tra ựã pha loãng 1/8 vào các lỗ tương ứng, 50 ộl/giếng, và pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A ựến hàng D và từ hàng E ựến hàng H
- Huyết thanh ựối chứng: chuẩn bị giống phát hiện kháng thể - Nhỏ kháng nguyên ựã pha loãng theo tỷ lệ cho trước 50 ộl/giếng. - Hỗn hợp kháng nguyên - huyết thanh ựược ủ qua ựêm ở 40C
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Sau khi thu thập và lấy kết quả, số liệu ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học trên phần mềm Xcel, MinitapẦ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI TRÂU BÒ TRÊN đỊA BÀN TỈNH NAM đỊNH TỪ NĂM 2008-2011
để ựánh giá tình hình chăn nuôi trâu bò trên ựịa bàn tỉnh Nam định trong 4 năm (từ năm 2008 ựến năm 2011) chúng tôi ựã tiến hành ựiều tra, thu thập số liệu qua Cục Thống kê tỉnh, phòng nông nghiệp các huyện thị và Ban Nông nghiệp các xã trên ựịa bàn toàn tỉnh. Kết quả ựược trình bày trên bảng 4.1 cho thấy:
Trong 4 năm (từ 2008 -2011), tổng ựàn trâu bò trên ựịa bàn tỉnh Nam định có xu hướng giảm liên tục, năm sau giảm so với năm trước 3,74%/năm. Trong ựó, ựàn trâu giảm bình quân 2,6%/năm, ựàn bò giảm bình quân 3,93%/năm. Cụ thể: năm 2008 tổng ựàn 50.046 con; năm 2009 tổng ựàn 48.259 con giảm 1.787 con (giảm 3,57%); trong ựó: trâu giảm 257 con (3,61%) ựàn bò giảm 1.530 con (3,56%).
So sánh giữa năm 2010 với năm 2009 cũng cho thấy: tổng ựàn trâu bò toàn tỉnh năm 2010 là 44.841 con, giảm 3.418 con (6,83%), trong ựó: ựàn trâu giảm 216 con (giảm 3,15%), ựàn bò giảm 3.202 con (giảm 7,47%).
Tương tự, tổng ựàn trâu bò năm 2011 là 44.430 con, so với năm 2010 giảm 411 con (giảm 0,82%). Trong ựó, ựàn trâu giảm 182 con (giảm 2,55%), ựàn bò giảm 329 con (0,77%). Tắnh trong thời gian 4 năm (từ 2008 ựến năm 2011), tổng ựàn trâu bò giảm 5.616 con (giảm 11,22%; bình quân năm sau giảm so với năm trước 3,74%), trong ựó ựàn trâu giảm 655 con (giảm 9,2%; bình quân mỗi năm giảm 3,07%); ựàn bò giảm 5.061 con (giảm 11,79%, bình quân mỗi năm giảm 3,93%)
Kết quả và tình hình chăn nuôi trâu bò trên ựịa bàn tỉnh Nam định từ năm 2008 ựến năm 2011 cũng ựược thể hiện qua hình 4.1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
Bảng 4.1. Tình hình chăn nuôi trâu bò trên ựịa bàn tỉnh Nam định từ năm 2008-2011
(Nguồn Cục Thống kê tỉnh Nam định)
Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Năm 2011
TT đơn vị Tổng số trâu bò (con) Trâu (con) Bò (con) Tổng số trâu bò (con) Trâu (con) Bò (con) Tổng số trâu bò (con) Trâu (con) Bò (con) Tổng số trâu bò (con) Trâu (con) Bò (con) 1 TP Nam định 1.129 126 1.003 918 75 843 765 106 659 703 62 641 2 Mỹ Lộc 4.362 193 4.169 4.223 175 4.048 4.170 202 3.968 4.150 99 3.951 3 Vụ Bản 6.898 585 6.313 6.410 576 5.834 6.076 757 5.319 6.109 786 5.323 4 Ý Yên 17.025 1.058 15.967 17.600 1.050 16.550 17.399 1.149 16.250 17.105 1.120 15.985 5 Nghĩa Hưng 4.206 1.653 2.553 3.333 1.642 1.691 2.716 1.406 1.310 2.615 1.371 1.244 6 Nam Trực 7.485 957 6.528 6.910 860 6.050 5.865 661 5.204 6.594 637 5.957 7 Trực Ninh 2.164 657 1.507 2.202 590 1.612 2.157 520 1.637 2.044 537 1.507 8 Xuân Trường 1.868 523 1.345 1.903 595 1.308 1.692 603 1.089 1.557 638 919 9 Giao Thủy 3.390 763 2.627 3.227 650 2.577 2.702 632 2.070 2.201 585 1.616 10 Hải Hậu 1.519 602 917 1.533 647 886 1.299 608 691 1.352 627 725 Toàn tỉnh 50.046 7.117 42.929 48.259 6.860 41.399 44.841 6.644 38.197 44.430 6.462 37.868
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Năm 2011
Trâu (con)
Tổng số trâu bò (con) Bò (con)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
4.2. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN TẠI NAM đỊNH TỪ NĂM 2008 đẾN NĂM 2011
Chúng tôi ựã tiến hành ựiều tra thu thập số liệu về tình hình chăn nuôi trên ựịa bàn tỉnh Nam định từ năm 2008 ựến năm 2011. Kết quả ựược trình bày trên bảng 4.2 cho thấy: tổng ựàn lợn từ năm 2008 ựến nay có xu hướng giảm nhẹ. Năm 2008 tổng ựàn lợn là 747.981 con; năm 2009 tổng ựàn 747.068 con (bằng 99,9% năm 2008); năm 2010 tổng ựàn 742.720 con (bằng 99,42% năm 2009); năm 2011 tổng ựàn 744.134 con (bằng 100,19% năm 2010).
đàn lợn nái có xu hướng tăng mạnh vào năm 2009; từ năm 2010, 2011 lại có xu hướng giảm. Cụ thể: năm 2008 tổng ựàn nái 141.866 con, năm 2009: 151.182 con (bằng 106,6% so với năm 2008), năm 2010: 147.718 con (bằng 97,7% so với năm 2009); năm 2011: 130.731 con (bằng 88,5% so với năm 2010). Số liệu thống kê hàng năm cũng cho thấy, ựàn lợn nái chiếm tỷ lệ cao trong ựàn. Bình quân 4 năm ựàn lợn nái chiếm 19,52% tổng ựàn. Nhìn vào số liệu này có vẻ không bình thường vì Nam định là ựịa phương chuyên cung cấp giống lợn cho các tỉnh lân cận mà sản phẩm cuối cùng của lợn nái là lợn thịt. Trong một chu kỳ kắn (lợn nái Ờ lợn giống Ờ lợn thịt), lợn nái chỉ chiếm 10-12% tổng ựàn. Tuy nhiên, ựiều này lại phù hợp với thực tế là ựàn lợn nái tại Nam định năm 2011 có 86,3% là lợn nái nội (lợn Móng Cái); 9,1% là lợn nái lai, 4,6% là lợn nái ngoại (báo cáo ựiều tra của trung tâm Giống Gia súc gia cầm tỉnh Nam định tháng 12/2011). đầu lợn nái chủ yếu ựược nuôi theo phương thức phân tán, chăn nuôi tận dụng ở các huyện phắa nam xa thành phố Nam định như Hải Hậu, Trực Ninh, Nghĩa Hưng và Ý Yên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
đàn lợn ựực có xu hướng tăng cao trong năm 2009 và giữ ổn ựịnh ựến năm 2011, Cụ thể năm 2008, tổng ựàn lợn ựực: 1.356 con (chiếm 0,18% so với tổng ựàn); 0,96% so với ựàn lợn nái). Năm 2009, tổng ựàn lợn ựực 1.631 con (chiếm 0,22% so với tổng ựàn; 1,08% so với ựàn lợn nái). Năm 2010 tổng ựàn lợn ựực 1.692con (chiếm 0,23% so với tổng ựàn; 1,15% so với ựàn lợn nái). Năm 2011 tổng ựàn lợn ựực 1.656 con (chiếm 0,22% so với tổng ựàn; 1,17% so với ựàn lợn nái). Bình quân 4 năm (2008-2011) ựàn lợn ựực chiếm 0,21% so với tổng ựàn; 1,09% so với ựàn lợn nái.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
Bảng 4.2. Tình hình chăn nuôi lợn trên ựịa bàn tỉnh Nam định (từ năm 2008-2011)
Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Năm 2011
Trong ựó Trong ựó Trong ựó Trong ựó
TT đơn vị Tổng số (con) Lợn nái (con) Lợn ựực (con) Lợn thịt (con) Tổng số (con) Lợn nái (con) Lợn ựực (con) Lợn thịt (con) Tổng số (con) Lợn nái (con) Lợn ựực
