- ðồ ng thời với việc lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà chúng tôi tiến hành lấy mẫu swab ñể xác ñịnh sự lưu hành củ a virus cúm
2.4.6.Phương pháp RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm
* Phản ứng RT-PCR: Dùng ñể giám sát sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 sau tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại 3 trại gà thí nghiệm ở huyện Chương Mỹ.
* Nguyên liệu
- Mẫu swab.
- Nước cất vô trùng (RNase free). - Quiagen®buffer RLT có β-MẸ - Cồn Ethanol 70%.
- RNA ñối chứng dương tính M, H5 và H7. - Kít chiết tách Qiagen® RNeasy Mini Kit.
- Kít RT/PCR One-Step RT/PCR với Platinium taq DNA polymerasẹ - Primer và probe cho H5N1
- RNase Inhibitor (13.3 units/µl); MgCl2; ñệm TE PH 8.0, 1 x. - β-Mercaptoethanol (β-ME).
* Chiết tách ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số từ mẫu dịch ngoáy (swab) bằng Qiagen® RNeasy Mini Kit. Các bước cụ thể như sau:
- Lắc mạnh (bằng máy Vortex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫụ
- Cho 500µl Qiagen® buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc ñều trên máy Vortex.
- Ly tâm (bằng máy Spindown) ñể dịch bệnh phẩm ñọng trên nắp trôi xuống
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 34
ñã bị dung giải trong 5 phút, tốc ñộ 5000xg ở nhiệt ñộ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy®Qiagen ñã ghi sẵn ký hiệu mẫụ Ly tâm trong 15 giây tốc ñộ ≥ 8000xg ở nhiệt ñộ phòng. Kiểm tra dịch mẫu ñã thấm qua cột lọc chưạ Lặp lại bước này cho toàn bộ mẫu ñã qua cột lọc.
Ngoài ra có thể dùng ống hút Quivac® ñể hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫụ Phương pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc.
- Bổ sung 700µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy®Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000 xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
- Cho 500µl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥
8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2ml vào cột lọc.
- Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña (khoảng 72.000 vòng/giây), bỏống thu mẫụ
- ðặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ñã ñược ghi sẵn ký hiệu mẫụ Cho 50µl RNase free vào cột lọc. Chú ý không ñược chạm ñầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 60.000 vòng/giâỵ Bỏ cột lọc RNeasy®.
- Bảo quản mẫu ARN thu ñược ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT- PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -20oC hoặc nhiệt ñộ thấp hơn.
* Thực hiện phản ứng RT-PCR
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 35 Bảng 2.1. Primer và probe ñặc hiệu cho virus cúm A/H5N1
Gen Primer/ Probe Chuỗi nucleotide (5’-3’) ðầu 5’ ðầu 3’
M Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Xuôi CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC
Ngược AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA H5 Probe TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA HEX BHQ1
Xuôi ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA
Ngược AGACCAGCTACCATGATTGC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N1 Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Xuôi TGGACTAGTGGGAGCAGCAT
Ngược TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC
- Chuẩn bị Master mix theo thành phần ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng Nguyên liệu Lượng (µl) Nước cất 4.5 2x Reaction buffer 12.5 MgCl2 (50mM) 1 Primer (xuôi) 0.5 Primer (ngược) 0.5 Probe 0.5 Enzyme mix 0.5 Tổng 20
+ Cho 20 µl Master mix vào ống PCR. + Cho 5 µl mẫu RNA vào ống PCR. + ðặt ống PCR vào máy RT - PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 36
+ Chạy chương trình.
+ Chọn ñọc màu ở bước kéo dàị - Chu trình nhiệt:
50oC – 15 phút 95oC – 2 phút
40 x (95oC – 10 giây + 58oC – 50 giây) - ðọc kết quả:
Xét nghiệm ñược công nhận khi:
ðối chứng dương tính cho giá trị Ct ñã biết (±2)
ðối chứng âm tính không có Ct
Mẫu ñược coi là dương tính khi có Ct ≤ 35 Mẫu ñược coi là âm tính nếu không có Ct Mẫu ñược coi là nghi ngờ nếu Ct >35