- ðồ ng thời với việc lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà chúng tôi tiến hành lấy mẫu swab ñể xác ñịnh sự lưu hành củ a virus cúm
2.4.5. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
* Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI): Sử dụng ñể kiểm tra hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng trên ñàn gà của 3 trại thí nghiệm tại huyện Chương Mỹ.
* Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch chống ñông máu (Citrat natri 5%):
- Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: NaCl 0,85%: - Dung dịch PBS 0,01M pH7.2
Các dung dịch trên, sau khi pha hấp tiệt trùng ở 121oC trong 30 phút.
* Pha dung dịch hồng cầu gà 1%:
- Máu gà trống khoẻ mạnh ñã trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastlẹ
- Dùng bơm tiêm 5 hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống ñông (Natri Citrat 5%) rồi lấy máu gà cho vào ống nghiệm.
- Ly tâm 1,000 – 1,500 vòng/phút, trong 15 phút, hút bỏ huyết tương và bạch cầu, cho thêm nước sinh lý (NaCL 0.85%) vào hồng cầu, lắc ñềụ Ly tâm như trên 3 - 4 lần ñể rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên.
- Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.
- Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt ñộ 4 - 80C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 31 * Xác ñịnh hiệu giá của virus kháng nguyên:
Dùng phản ứng ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin – HA) ñể chuẩn ñộ
kháng nguyên chuẩn H5.
Dùng ñĩa làm phản ứng ngưng kết có các giếng, ñáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng.
- Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn: Kháng nguyên là virus cúm vô hoạt subtype H5 chuẩn. Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 4 ñơn vị HA/25µl.
+ Hồng cầu gà 1%. - Tiến hành phản ứng:
Cho 25µl PBS (pH7,2) vào các giếng từ cột 1 ñến cột 12 hàng A và B. Cho 25µl kháng nguyên chuẩn vào các giếng ở cột 1 của hàng A và B.
Pha loãng bậc 2 kháng nguyên kiểm trạ Chuyển 25µl từ giếng 1 ñến giếng 11 rồi bỏñi 25µl.
Cột 12 dùng làm ñối chứng, chứa 25µl PBS và 25µl hồng cầu gà 1%. Cho 25µl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng.
Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máỵ ðểở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñọc kết quả. - ðọc kết quả:
Phản ứng (-): Hồng cầu lắng ñều ở dưới ñáỵ
Phản ứng (+): Xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
ðọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên ñược ñánh giá ở ñộ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy rạ
- Xác ñịnh tỷ lệ pha kháng nguyên 4HA thích hợp:
Lấy ñộ pha loãng cuối cùng có ngưng kết hồng cầu chia cho 4. Ví dụ: Hiệu giá HA mà chúng ta kiểm tra ñược là 1/128.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 32
Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên chuẩn với 31 phần PBS ñể ñạt ñược dung dịch kháng nguyên 4 HẠ
* Xác ñịnh hiệu giá kháng thể:
Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination Inhibition - HI) ñể xác ñịnh hiệu giá kháng thể của gà ñã ñược tiêm vaccine cúm gia cầm.
ðĩa làm phản ứng ngăn trở ngưng kết có ñáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng. - Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn (subtype H5) 4 ñơn vị HA/25µl. + Hồng cầu gà 1%.
+ Huyết thanh: Huyết thanh làm phản ứng ñược chắt từ mẫu máu gà thí nghiệm và máu gà ñối chứng, bảo quản ở 4 - 80C.
- Tiến hành phản ứng:
Nhỏ 25µl PBS vào các giếng ñáy chữ V của ñĩa 96 giếng. Nhỏ tiếp 25µl huyết thanh vào giếng ñầu tiên (từ A1 → H1).
Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25µl huyết thanh từ
giếng 1 sang giếng 2 và tuần tựñến giếng 11 và bỏñi 25µl cuối cùng.
Nhỏ 25µl kháng nguyên 4 HA ñã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25µl PBS vào hàng ñối chứng hồng cầu (giếng 12).
Lắc ñĩa và ủở nhiệt ñộ phòng 30 phút. Nhỏ 25µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng của ñĩa, lắc ñềụ ðểở nhiệt ñộ phòng và ñọc kết quả sau 30 phút. - ðọc kết quả: Phản ứng (+) (tức là có kháng thể): Có hiện tượng hồng cầu lắng xuống ñáy thành cục tròn giống nhưñối chứng. Phản ứng (-) (không có kháng thể): Có hiện tượng ngưng kết xảy ra ở giếng phản ứng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 33
Hiệu giá kháng thể HI là ñộ pha loãng huyết thanh cao nhất vẫn còn lượng kháng thểñể ngăn cản 4HA virus gây ngưng kết hồng cầụ
Trong máu gà, nếu hiệu giá HI ≥ 4log2 thì cá thể gà ñó ñược bảo hộ ñối với virus cúm cường ñộc.