Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendorf 0,2ml và thực hiện trên máy eppendorf.

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau:

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nước cất hai lần khử ion 3,2 2 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM 1

3 dNTPs 10mM 1,0

4 Taq DNA polymerase 1U/µl 0,8

5 Mồi xuôi 5µM 1,5

6 Mồi ngược 5µM 1,5

7 DNA 10g/µl 1

Tổng thể tích của một phản ứng 10,0

Điều kiện phản ứng PCR:

Các bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

I 94 5 phút 1 II 94 45 giây 35 72 1 phút 72 1 phút III 72 8 phút 1 Giữ mẫu ở 40 C 2.2.3. Điện di sản phẩm PCR

Điện di sản phẩm SSR trên gel polyacrylamide cần thực hiện các bước sau:

* Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol.

* Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được

khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào.

* Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm

thủy tinh đó, rồi đặt tấm thủy tinh có "tai" lên rên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau.

* Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên và khe

hở đáy bản gel bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp).

Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không cần kẹp.

Bản gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm): - Nước cất khử ion : 22,2ml - 10X TBE : 1,5ml - Dung dịch acrylamide 40% : 6ml - Dung dịch APS 10% : 300µl - Dung dịch TEMED : 25µl Tổng thể tích gel : 30ml

* Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm đầy vào giữa hai

tấm kính, không để có bọt khí.

* Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến

hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker phiX174 có trọng lượng chuẩn (ΦX174ADN/HinfI, 20g/µl) ở điều kiện 150V.

* Thời gian điện di khoảng 3giờ-4giờ. Lấy gel ra khỏi kính và được nhuộm

Ethidium bromide nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel.