IV. 1B nh p hm
V.4 Thí nghi đd nh danh S.aureus
Chapman Coagulase Urease ODC
+ + V - Chú thích: +: h n 90% ch ng cho k t qu d ng tính. -: h n 90% ch ng cho k t qu âm tính. V: 11-89% ch ng cho k t qu d ng tính. ([22]) V.4.1 Chapman: 1/ M c đích:
Th nghi m lên men manitol dùng đ phân bi t S.aureus v i các ch ng Staphylococci
khác.
2/ Nguyên t c:
S.aureus lên men đ c đ ng mannitol trong môi tr ng Mannitol salt agar ch a 7.5% NaCl (hay còn g i là Chap man) làm thay đ i pH6.8 môi tr ng chuy n sang màu vàng. Các ch ng Staphylococci khác không lên men Manitol nên môi tr ng s gi màu đ .
3/ Môi tr ng
Môi tr ng Chapman, ch th màu Phenol red, pH ả6,8. 4/ Thao tác
Hút 1ml n c c t vào tube vô trùng.
Ch n khu n l c đ c tr ng cho S.aureus, dùng pipet l y 3-4 khu n l c đ c tr ng cho vào tube vô trùng. L c đ u.
Hút huy n d ch vi khu n vào pipet nh lên b m t ng th ch nghiêng. y n p ng nghi m nh ng không đ y ch t.
370C, 18-24h.
5/ K t qu
(+): chuy n t màu đ sang vàng có lên men mannitol. (-): v n gi nguyên màu l c, không lên men mannitol. ([22])
V.4.2 Coagulase:
1/ M c đích:
Th nghi m Coagulase dùng đ phân bi t S.aureus v i các Staphylococci khác
2/ Nguyên t c:
Enzym coagulase có 2 d ng: coagulase liên k t và coagulase t do (lo i coagulase liên k t đ c xác đnh b ng k thu t trên kính, còn lo i coagulase t do đ c xác đnh b ng k thu t trong ng nghi m), đ c phát hi n khi g p huy t t ng t o l n c n ho c làm đông huy t t ng
S.aureus có enzyme coagulase có kh n ng gây đông huy t t ng th
3/ Môi tr ng:
Huy t t ng th đông khô
4/ Thao tác
L y 1ml NaCl cho vào tube huy t t ng th đông khô, l c nh đ tr n đ u.
L y 1ml NaCl cho vào tube vô trùng ch n khu n l c đ c tr ng cho S.aureus, dùng pipet l y 3-4 khu n l c đ c tr ng cho vào tube vô trùng. L c đ u.
Hút huy n d ch vi khu n vào pipet cho vào tube ch a huy t t ng th . L c nh đ
tr n đ u.
370C, 18-24h.
(-): không đông huy t t ng th k t lu n là Staphylococci coagulase negative
(SCN). ([22])
V.5 K thu t xác đnh tính nh y c m kháng sinh c a S.aureus: V.5.1 Th c hi n ph ng pháp kháng sinh đ Kirby Bauer V.5.1 Th c hi n ph ng pháp kháng sinh đ Kirby Bauer
V.51.1 Nguyên t c
Kháng sinh đ c t m vào gi y theo n ng đ cho t ng lo i. Kháng sinh s khu ch tán chung quanh m t th ch môi tr ng nuôi c y. ng kính vòng vô khu n b c ch di n đ t tính nh y c m c a vi khu n đ i v i kháng sinh.
Ph ng pháp này đ c y Ban Qu c Gia v các Chu n M c Phòng Thí Nghi m Lâm Sàng CLSI-2012 ch p thu n và bi n lu n theo CLSI.
V.5.2 Cách ti n hành.
V.5.2.1 V t li u.
a gi y t m kháng sinh: đ ng kính 6 mm, t m kháng sinh v i n ng đ
tiêu chu n cho t ng lo i kháng sinh.
Môi tr ng th ch c b n: MHA (Mueller Hinton Agar).
Dung d ch chu n đ đ c 0,5 McFarland.
D ch khu n th nghi m: 1-2 ×108 CFU/ml, t ng đ ng v i đ đ c 0,5 McFarland ho c đo đ h p ph b c sóng 625nm đ t 0,08-0,1.
V.5.2.2 Pha huy n d ch vi khu n
Pha huy n d ch vi khu n có n ng đ 0,5 McFarland. Huy n d ch vi khu n nh v y ch a 1-2×108t bào/ml.
Pha huy n d ch vi khu n tr c ti p t khóm vi khu n.
Ch n ít nh t t 3-5 khóm vi khu n gi ng nhau l y t m t th ch đã nuôi c y t 18-24 gi , cho vào môi tr ng l ng hay trong n c mu i sinh lý NaCl 0,85 %. i u ch nh huy n d ch vi
th c hi n đ c chính xác b c này thì có th dùng quang k hay nhìn b ng m t th ng b ng cách dùng đ ánh sáng đ so sánh tube ch a vi khu n v i tube đ đ c chu n 0.5 McFarland trên m t t m bìa c ng có k nh ng v ch đen.
V.5.2.3 Tr i khu n trên m t th ch.
Trong vòng 15 phút sau khi pha huy n d ch vi khu n, đ đ u ph kín huy n d ch lên m t th ch MHA, dùng pipet vô trùng hút h t huy n d ch trong đ a, l u ý không đ huy n d ch đ ng l i nhi u trên m t th ch và ph i láng đ u đ m b o vi khu n đ y trên m t th ch.
cho m t khô tr c khi đ đa kháng sinh lên m t th ch.
L u ý: tránh tr i m m c y quá dày. Tuy t đ i không bao gi tr i vi khu n t canh c y vi khu n qua đêm không pha loãng hay không đúng đ đ c chu n.
V.5.2.4 t đa kháng sinh lên m t th ch đã tr i vi khu n.
Xác đnh b đ a kháng sinh nào đ t lên m t th ch. Khi đ t ph i ép nh m i đa kháng sinh đ đ m b o chúng ti p xúc hoàn toàn v i m t th ch. t đa kháng sinh b ng tay ho c b ng d ng c phân ph i đa đ u ph i đ m b o các tâm đa kháng sinh không g n nhau d i 24 mm và cách mép h p Petri ≥12mm.
Kháng sinh khu ch tán ngay sau khi đa kháng sinh ch m m t th ch, vì v y không nên d i ch các đa kháng sinh sau khi đã đ t lên m t th ch.
Trong vòng 15 phút sau khi đã đ t các đa kháng sinh, ph i s y h p th ch (đáy trên, n p d i) 350C. ([22])
V.5.3 Th ngi m D-test:
a Erythromycin đ c đ t g n (kho ng 20 mm) vào đa Clindamycin. Erythromycin s ho t đ ng nh m t tác nhân phân l p th hi n gen erm t o thành khu v c hình ch D xung quanh đ a Clindamycin. ([22])
Hình 10: D-test d ng tính[10]
V.5.4 c và bi n lu n k t qu
o đ ng kính vòng vô khu n thành mm tròn, b ng compa tr t, th c k tr t hay th c dành riêng cho m c đích này b ng cách áp th c lên m t sau c a đáy h p th ch và r i b ng ánh sáng ph n chi u.
Chu vi vòng vô khu n là vùng nhìn th y b ng m t th ng, không th nhìn th y vi khu n m c. Không c n đ ý đ n các khóm vi khu n li ti hay s t ng tr ng nh c a vi khu n bên trong vòng vô khu n mà ch có th th y b ng kính lúp. Tuy nhiên các vi khu n này ph i c y, đnh danh và th nghi m l i.
Các v n đ l u ý khi đ c kháng sinh đ :
- o đ ng kính vòng vô khu n b ng mm tròn. Các tr ng h p khác n u có hai vòng vô khu n là do đ t kháng sinh đ lúc m t th ch còn t ho c vi khu n không thu n, khi đó ph i làm l i kháng đ .
- K t qu kháng sinh đ không chính xác n u:
+ t kháng sinh đ khi m t th ch còn t.
Bi n lu n đ ng kính vòng vô khu n, ghi nh n k t qu vi khu n kháng, nh y hay trung gian v i kháng sinh theo CLSI 2012. ([22])
V.6 Ph ng pháp thu th p và x lý s li u.
Thu th p s li u: Thu th p và nh p d li u vào s và Excel.
CH NG III: K T QU , BÀN LU N
I. K T QU
I.1. K t qu chung v nuôi c y phân l p các loài vi khu n t máu và m .
Trong th i gian th c t p b nh vi n t tháng 11/2013 đ n tháng 4/2014, th ng kê trên nh ng b nh ph m máu và m thu đ c t i b nh vi n Nhi đ ng II, Tp H Chí Minh đ c b ng v t l các loài vi khu n phân l p t b nh ph m máu và m nh sau:
B ng 5:T l các loài vi khu n phân l p t b nh ph m máu S l ng M u n % D ng tính 554 6.98 Ngo i nhi m 744 9.37 Âm tính 6644 83.66 T ng 7942 100
Nh n xét: Theo k t qu trên ta th y đ c s l ng m u âm tính cao h n s l ng m u d ng tính.
B ng 6: T l các loài vi khu n phân l p t b nh ph m m S l ng M u n % D ng tính 146 50 Âm tính 146 50 T ng 292 100
Nh n xét: Theo k t qu trên ta th y đ c s l ng m u âm tính b ng m u d ng tính.
I.2. T l các lo i vi khu n phân l p đ c t máu và m .
Các m u b nh ph m máu và m sau quá trình kh o sát m u ban đ u, đ c đem đi c y trên các môi tr ng CA, BA, BCP ta thu đ c t l các lo i vi khu n phân l p đ c trong t ng s m u b nh ph m máu và m t các khoa lâm sàng g i đ n khoa Vi sinh.
B ng 7: T l các lo i vi khu n phân l p đ c t b nh ph m máu
STT Vi khu n n %
1 Staphylococcus aureus 29 5.23
2 Staphylococci coagulase negative (SCN) 136 24.55
3 Klebsiella pneumoniae 38 6.86 4 Streptococcus pneumoniae 21 3.79 5 Escherichia coli 29 5.23 6 Acinetobacter spp 43 7.76 7 Bacillus spp 8 1.44 8 Burkholderia cepacia 169 30.51 9 Enterobacter cloacae 10 1.81 10 Vi khu n khác 71 12.82 T ng 554 100 Nh n xét:
- Trong s 554 m u b nh ph m máu d ng tính các vi khu n Gram âm có t l phân l p cao h n các vi khu n Gram d ng.
- Trong đó t c u khu n S.aureus có t l phân l p khá th p, chi m 5.23%.
0 5 10 15 20 25 30 35 5.23 24.55 6.86 3.79 5.23 7.76 1.44 30.51 1.81 12.82
B ng 8: T l các lo i vi khu n phân l p đ c t m .
STT Vi khu n n %
1 Staphylococcus aureus 59 40.41
2 Staphylococci coagulase negative (SCN) 2 1.37
3 Escherichia coli 30 20.55 4 Acinetobacter spp 10 6.85 5 Enterobacter cloacae 2 1.37 6 Enterobacter faecalis 3 2.05 7 Pseudomonas aeruginosa 8 5.48 8 Klebsiella pneumoniae 12 8.22 9 Vi khu n khác 20 13.70 T ng 146 100 Nh n xét:
- Trong s 146 m u b nh ph m m g i đ n khoa Vi sinh các vi khu n Gram âm có t l phân l p cao h n các vi khu n Gram d ng.
- Trong đó t c u khu n S.aureus có t l phân l p cao nh t chi m t l 40.41%.
I.3. K t qu phân l p S.aureus trên b nh ph m máu và m .
T l phân l p S.aureus đ c tính trên các b nh ph m d ng tính.
B ng 9: K t qu phân l p S.aureus trên b nh ph m máu và m
STT B nh ph m n %
1 Máu 29 5.23
2 M 59 40.41
T ng 88 -
Nh n xét: T l phân l p S.aureus trong b nh ph m máu có t l khá th p kho ng 5.23%, th p h n trong b nh ph m m chi m t l khá cao vào kho ng 40.41% .
I.4. S phân b S.aureus theo gi i tính.
B ng 10: T l b nh nhân b nhi m S.aureus theo gi i tính B nh ph m Máu M n % n % Nam 14 48.28 32 54.24 N 15 51.72 27 45.76 T ng 29 100 59 100
Nh n xét:T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m máu nam (48%) th p h n n (52%) kho ng 4%.
T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m m nam (54%) cao h n n (46%) kho ng 9%.
Bi u đ 8: T l b nh nhân b nhi m S.aureus theo gi i tính trên b nh ph m máu
I.5. S phân b S.aureus theo đ tu i.
i v i các m u b nh ph m máu và m c a b nh nhi d ng tính v i S.aureus
trong b nh vi n Nhi ng II, chia ra 3 m c tu i đ th ng kê.
B ng 11: T l phân l p S.aureus theo đ tu i B nh ph m Máu M n % n % <1 7 24.14 15 25.42 >=1 đ n <=5 8 27.59 36 61.02 >5 14 48.28 8 13.56 T ng 29 100 59 100 Nh n xét:
- Có s khác bi t v đ tu i trong hai m u b nh ph m máu và m d ng tính v i
S.aureus, c th :
- Trong b nh ph m máu, t l nhi m tr em >5 tu i là cao nh t chi m 48.28%, theo sau
đó là đ tu i t >=1 đ n <=5 tu i chi m 27.59%, th p nh t là đ tu i <1 tu i chi m 24.14%. Trong b nh ph m m , t l nhi m tr em t >=1 đ n <=5 tu i là cao nh t chi m 61.02%, theo sau đó là đ tu i <1 tu i chi m 25.42%, th p nh t là đ tu i >5 tu i chi m 13.56%.
Bi u đ 11: T l phân l p S.aureus theo đ tu i trên b nh ph m m
I.6. T l phân l p S.aureus theo khoa.
B ng 12: T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m máu theo khoa
Khoa n % N i T ng H p 3 10.34 Ung B u Huy t H c 9 31.03 Ngo i T ng H p 1 3.45 C p c u Nhi m 2 6.90 C p c u L u 3 10.34 D ch v 1 3.45 S sinh 5 17.24 Tiêu Hóa 2 6.90 Th n Kinh 1 3.45 Th n N i Ti t 2 6.90 T ng 29 100 Nh n xét:
Có s khác bi t v t l b nh nhân b nhi m S.aureus theo khoa trên b nh ph m máu. C th :
- Cao nh t là khoa Ung B u Huy t H c chi m t l 31.03%, ti p theo là khoa S Sinh v i t l 17.24%. Th p nh t là các khoa Ngo i T ng H p, D ch v và Th n Kinh v i t l 3.45%.
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 10.34 31.03 3.45 6.90 10.34 3.45 17.24 6.90 3.45 6.90
Bi u đ 12: T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m máu theo khoa B ng 13: T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m m theo khoa
Khoa n % B ng Ch nh Tr c 15 25.42 D ch V 7 11.86 M 1 1.69 Ngo i Th n Kinh 2 3.39 Ng ai T ng H p 9 15.25 Ni u 1 1.69 N i Tông H p 8 13.56 S Sinh 8 13.56 Ph ng 1 1.69 Tim M ch 2 3.39 Ung B u Huy t H c 5 8.47 T ng 59 100.00 Nh n xét:
Có s khác bi t v t l b nh nhân b nhi m S.aureus theo khoa trên b nh ph m m . C th :
- Cao nh t là khoa B ng Ch nh Tr c v i t l 25.42%, ti p theo là khoa Ngo i T ng H p. Th p nh t là các khoa M , Ni u, Ph ng chi m t l 1.69%.
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 25.42 11.86 1.69 3.39 15.25 1.69 13.5613.56 1.69 3.39 8.47
Bi u đ 13: T l b nh nhân b nhi m S.aureus trên b nh ph m m theo khoa I.7 M c đ nh y c a kháng sinh c a S.aureus:
V i th c tr ng s d ng kháng sinh b a bãi không theo ch đnh c a bác s , đã d n đ n vi c kháng kháng sinh hay có m t s lo i vi khu n kháng đa kháng sinh gây r t nhi u khó kh n cho ngành y t . Vì th vi c đ nh danh và làm kháng sinh đ đ xác đnh vi khu n nh y