Vi kh un nghiên cu

Một phần của tài liệu Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm máu và mủ tại Bệnh viện Nhi Đồng 2 từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 04 năm 2014 (Trang 45 - 92)

Các ch ng S.aureus đ c nuôi c y và phân l p t các m u b nh ph m máu, m thu

đ c t các b nh nhi.

III. Th i gian và đa đi m nghiên c u

Th i gian: t tháng 11-2013 đ n tháng 04-2014. a đi m: b nh vi n Nhi đ ng II, Tp H Chí Minh.

IV. B nh ph m, môi tr ng phân l p xác đnh vi khu n và sinh ph m

IV.1 B nh ph m

- Máu và m c a b nh nhi t i b nh vi n nhi đ ng II t tháng 11-2013 đ n tháng 1-2014 IV.2 Môi tr ng

- Nuôi c y phân l p: BCP, BA, CA.

- Môi tr ng xác đnh đ nh y c m c a vi khu n v i kháng sinh: MHA. - Môi tr ng đ nh danh: Chapman, Huy t t ng th đông khô, Urease, ODC. IV.3 Sinh ph m + B nhu m gram: - Crystal violet. - Lugol. - Alcohol – acetol. - Safranin.

+ Hóa ch t: dùng đ pha môi tr ng, n c c t, n c mu i sinh lý. + Thu c th .

+ a kháng sinh.

- S d ng đ a kháng sinh c a hãng Biorad.

- Các đa kháng sinh đ t cho S.aureus g m: Penicilline, Oxacilline, Gentamycine, Ciprofloxacin, Erythromycin, Clindamycin, Vancomycin, Trime-sulfame, Chloram, Rifampin.

STT Tên kháng sinh Ký hi u N ng đ đa kháng sinh Gi i h n (mm) 1 Penicilline P 10 µg ≥28 ≤29 2 Oxacilline Ox 30µg ≥21 ≤22 3 Gentamycine CN 10µg ≥12 ≤15 4 Erythromycin E 15µg ≥13 ≤23 5 Rifampicin RD 5µg ≥16 ≤20 6 Ciprofloxacin CIP 5µg ≥15 ≤21 7 Vancomycin VA 30µg - - 8 Clindamycin CD 2µg ≥14 ≤21 9 Chloramphenicol C 30µg ≥12 ≤18 10 Trimethoprime- Sulfamethoxazone (Bactrime) SXT 25µg ≥10 ≤16

B ng 4: Các đa kháng sinh đ t cho S.aureus

IV.4 Thi t b

- T an toàn sinh h c. - T m 35 – 370C.

- T CO2 5% CO2, 35-370C. - T l nh.

- Máy l c ng nghi m (Vortex). - Kính hi n vi.

IV.5 Trang b khác - D u soi kính hi n vi. - Gi y lau v t kính hi n vi. - Khuyên c y/ pipet Pasteur. - Giá ng nghi m.

- G ng tay, kh u trang, nón, áo choàng, dung d ch kh khu n.

V. Phân l p và xác đnh V.1 Ph ng pháp nghiên c u

- Xác đnh m c đ kháng kháng sinh c a S.aures phân l p đ c b ng ph ng pháp Kirby-Bauer theo h ng d n c a CLSI- 2012 (Hoa k ).

- Môi tr ng, sinh ph m và đa kháng sinh c a hãng Bio-Rad. - Thu th p và nh p d li u vào s và Excel.

- X lý k t qu b ng Excel.

V.2 K thu t nghiên c u

V.2.1B nh ph m:

V.2.1.1 M u máu

V.2.1.1.1 Th i đi m l y m u:

Tr c khi b nh nhân dùng kháng sinh và t t nh t là khi b nh nhân b n l nh ho c đang l nh run tr c ho c khi đang lên c n s t.

V.2.1.1.2 Ph ng pháp:

Chu n b :

-Chai c y máu đ nhi t đ phòng kho ng 15 phút tr c khi b m máu. Sát trùng và ch n nút chai b ng gòn t m c n 70% .

-L y kim tiêm ra kh i bao, ki m tra kim có thông không.

L y m u:

- Ch n t nh m ch, bu c dây garo phía trên cách ch l y máu kho ng 5cm.

- Sát khu n vùng da đã ch n t nh m ch: Dùng k p l y gòn nhúng vào dung d ch sát khu n nh : Povidine 3.5% ho c Chlohexidine, lau t trong ra ngoài, đ n khi khô. Lau

s ch b ng bông gòn th m c n 70%. Sát khu n nh trên 1 l n n a đ n khi khô ( tránh nhi m khu n tr l i không l y tay ch m vào vùng t nh m ch).

- Tiêm kim vào t nh m ch, kéo nh , rút đ l ng máu c n thi t (tr s sinh:1-2ml, tr l n:2-5ml), tránh t o b t khí.

- Tháo dây garo, rút kim, ép nh bông th m c n vào ch tiêm.

- B gòn trên chai c y máu ch khô, b m máu v a l y vào chai (nh nhàng tránh tán huy t). Kh trùng n p chai c y máu l n n a sau khi rút kim.

V.2.1.1.3 V t li u l y và chuyên ch

V t li u l y m u: Chai c y máu BACTEC. Chuyên ch :

- Chai c y máu: B o qu n t 2-250C.

- Chai c y máu sau khi b m chuy n đ n khoa Vi sinh càng s m càng t t và ph i đ c x lý trong vòng 2h sau khi l y m u. N u vì lý do nào đó không th kh o sát ngay thì có th gi m u b nh ph m trong t l nh nhi t đ 2-30C nh ng không quá 2 gi t khi l y m u. B o qu n nhi t đ th ng khi v n chuy n.

V.2.1.2 M u m

V.2.1.2.1 Th i đi m l y m u

- Càng giai đo n s m c a b nh càng t t. Ngh a là ti n hành l y m u ngay sau khi có ch n

đoán lâm sàng.

V.2.1.2.2 Ph ng pháp:

Chu n b : T m bông vô trùng L y m u:

D a vào m ng i ta chia làm 2 lo i:

1. m đã v (bao g m v t th ng h có m ): - Lau s ch vùng da xung quanh v i c n 70%

- Lau s ch m trên v t th ng b ng g c vô trùng th m n c mu i sinh lý - Dùng t m bông đã th m n c mu i sinh lý đ l y b nh ph m

*N u v t th ng b nhi m trùng, c t l c vùng mô d i l p m đã lau s ch, n n n m , dùng t m bông vô trùng đ th m sau đó cho vào l vô trùng

2. m kín:

- Sau khi sát trùng vùng da bên ngoài, đ khô, ch c kim hút l y m ho c d ch b m vào l vô trùng

- L y đ c nhi u m : b m vào l vô trùng

- L y đ c ít m : hút thêm Nacl sau đó cho vào l vô trùng

V i m m i, khi hút thì b m NaCl vào, sau đó hút l i, cho vào l vô trùng V.2.1.2.3 V t li u l y và chuyên ch

V t li u l y m u: T m bông vô trùng Chuyên ch :

- Chai c y máu: b o qu n t 2-250C

- M u m sau khi l y chuy n đ n khoa Vi sinh càng s m càng t t và ph i đ c x lý trong vòng 2h sau khi l y m u. B o qu n nhi t đ th ng khi v n chuy n.([22])

V.3 Qui trình nuôi c y phân l p và xác đnh S.aureus: V.3.1 Nguyên t c: V.3.1 Nguyên t c:

- Phân l p hay tách r i vi khu n t m t h n h p d a trên nguyên t c làm c n d n m m c y.

- Các vi khu n s m c tùy theo t ng lo i môi tr ng và nhi t đ .

-D a vào khu n l c đ c tr ng t đó đ nh danh vi sinh v t b ng các ph n ng sinh hóa chuyên bi t, ng ng k t.

- Làm kháng sinh đ b ng ph ng pháp đa gi y khuy ch tán kháng sinh trong th ch MHA.([23])

V.3.2 Nh n và đ ng kí m u

B nh ph m là: máu và m đ c g i t các khoa lâm sàng đ n khoa vi sinh t i b nh vi n nhi ng II t tháng 11/2012 đ n tháng 1/2013.

Thông tin v đ tu i, gi i tính đ c ghi vào phi u xét nghi m.

Có s liên h ch t ch gi a khoa đi u tr và phòng vi sinh đ ghi nh n thông tin đ y đ

và chính xác. ([22])

V.3.3 Quy trình nuôi c y, phân l p:

V.3.3.1 C y máu:

V.3.3.1.1 Kh o sát vi th

1. t chai c y máu vào trong máy c y máu

2. Khi máy c y máu báo d ng: l y chai d ng ra kh i máy, ki m tra mã code trên chai và phi u xét nghi m xem có s trùng kh p hay không

3. L y chai c y máu d ng ti n hành nhu m Gram, soi t i và c y:

 Sát khu n chai c y máu b ng c n 70% đ khô, b t đèn gas ho c đèn c n, h l a đ u chai và l c đ u.

 Dùng kim tiêm vô trùng đâm vào đ u chai và l y m t l ng máu đ đ : soi t i, nhu m Gram và c y vào 3 môi tr ng BA, CA, BCP (c y ria)

* C y:

- Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi trong t m, t CO2 kho ng 18-24h, tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ

- các đ a môi tr ng:

 CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .

 BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .

 ng SAD (1 ng nhi t đ phòng/18-24 gi , 1 ng 370C/18-24 gi ) * Soi t i và nhu m Gram:

- Chu n b 2 lame kính vô trùng

+ Lame 1: nh m t gi t máu đ soi t i (soi t i đ quan sát s di đ ng và hình d ng vi khu n)

+ Lame 2: nh m t gi t máu và tr i đ u thành m t ph t 2-3 cm/lame. khô t nhiên sau đó h nh qua ng n l a đèn c n đ c đnh m u.

- Nhu m Gram:

* N u nhu m Gram th y:

- N m: chuy n vào 2 ng SAD (c y ria trên th ch nghiêng)

- Tr c khu n gram âm nh ng n (nghi ng Gaemophilus) v ch 1 đ ng t c u lên h p th ch BA sau khi c y b nh ph m

- C u khu n Gram d ng đôi chu i: đ t thêm đa kháng sinh Optochin và Bacitracin lên h p BA. Theo dõi và làm kháng sinh đ n u th y vi khu n m c (k t qu nhu m soi th y thu n 1 lo i vi khu n)

V.3.3.2 C y m :

V.3.3.2.1 Kh o sát đ i th : màu s c, đ đ c, mùi Màu s c: đ , vàng, xanh lá, nâu đ , h ng…

D ch hút abces gan (th ng do amip): đ c, nâu s m ho c vàng nh t

M t v t th ng sau ph u thu t ho c ch n th ng, b ng: xanh lá (th ng do

P.aeruginosa)

Mùi: th i, tanh, h ng…

Hôi: do vi khu n k khí ho c h n h p hi u, k khí

M u b nh ph m có mùi v i k t qu nhu m Gram: báo cho lâm sàng đ đ nh h ng s

S đ 1: QUY TRÌNH C Y MÁU BACTEC (+) Nhu m Gram: -B t màu gram -Hình d ng, cách s p x p -BCP ( t th ng) - 2 ng SABOURAUD (1 nhi t đ phòng, 1 t m) -BA, CA ( t CO2)

Báo cáo ngay cho lâm sàng: -Hình d ng: Cocci ho c Baci -Gram (+) ho c Gram (-)

nh danh KS

- nh danh: Làm tr c nghi m sinh hóa, api, ng ng k t

Theo k t qu nhu m Gram và đ c khóm trùng sau khi c y

C y

Khóm trùng

Tính ch t: l ng, đ c, nh y, có l n máu…

Mù ng t c : có h t l u hu nh màu vàng, b nh vùng m t c do Actinomyces

Chi d i, m abces: ch a h t nh nhi u màu ( đen, đ …) là do u n m ho c u h t M abces l nh do lao: gi ng phomat ho c bã đ u

V.3.3.2.2 Kh o sát vi th :

- S d ng que ph t l y m (c y tr c làm lam nhu m sau) l n nh nhàng trên 3 môi tr ng CA, BA, BCP và lam đã kh trùng, không c xát ho c quá áp sát

- Nhu m gram.([22]) M Nhu m Gram Báo cáo K t qu s b cho lâm sàng Ch K t qu c y Không có vi khu n ho c đa nhi m C y: -BA, CA ( t CO2) -BCP ( t th ng) -SABOURAUD nh danh: Tr c nghi m sinh hóa, ng ng k t, api, huy t thanh, kháng sinh đ S đ 2: QUY TRÌNH C Y M c khóm trùng N u có vi khu n thu n khi t

Nhu m Gram

Nguyên t c

Do s khác bi t v c u trúc t bào, vi khu n Gram d ng s gi đ c ph c h p màu tím Getian-iode và không b t y màu b i alcool trong khi vi khu n Gram âm không gi đ c ph c h p này.

Cách ti n hành [14]

A.T o phi n ph t

Ghi tên m u ho c s nh n di n trên lam (lam ph i s ch và khô).

Dùng vòng c y l y m t vòng c y đàm (ch n vùng nh y m ), n u l ng l y 2-3 khuyên tr i đ u trên mi ng lam 1x2 cm, đ khô t nhiên.

C đnh b ng cách dùng c n tuy t đ i ho c đ a nh nhàng lam kính c t ngang ng n l a

đèn c n 2-3 giây tránh làm quá nóng. B.K thu t nhu m

t lam đã ph t m u lên giá đ ng.

Nh vài gi t Crystal violet cho ph đ u lên b m t ph t nhu m và đ yên trong 1 phút. b dung d ch Crystal violet và r a s ch lam kính t t , nh nhàng b ng n c máy. Lugol cho ph trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1 phút.

R a l i lam b ng n c máy t t và nh nhàng.

T y màu b ng cách c m m t đ u lam và nh t t Alcohol 95% ho c Alcohol– Acetol lên ph t nhu m cho đ n khi vùng phi n kính b c màu đi (thông th ng là t 10 đ n 15 giây).

R a nhanh b ng n c (m s n vòi n c tr c khi b t đ u kh màu).

Nh vài gi t Safrafin cho ph đ u lên trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1phút.

R a nhanh b ng n c nh nhàng và đ khô t nhiên và quan sát d i kính hi n vi v t kính d u ×100 (v t kính ×10), tìm vùng nh y nh t r i ghi nh n s l ng t bào v y (là các t bào có góc c nh) và các t bào b ch c u hay t bào m (là các t bào tròn nh h n, n đ m màu trên toàn t bào).Vi khu n Gram d ng b t màu tím, Gram âm b t màu h ng. ([2])

C y phân l p

Nguyên t c

Ph ng pháp c y phân l p tách riêng bi t t ng t bào vi sinh v t trên môi tr ng nuôi c y. T m t t bào ban đ u sau m t th i gian nuôi c y s t o ra m t khóm hay khu n l c.

Qui trình

1. V i m u máu: Sau khi sát trùng chai c y máu Batec, s d ng kim tiêm rút l ng máu v a đ đ c y, nhu m gram và soi t i.

V i m u m : - Nh ng m u có que gòn thì dùng que gòn l n đ u trên các h p th ch và lam kính, sau đó ngâm que gòn vào canh thang l u m u.

- Nh ng m u m d ng d ch thì dùng Pipet pasteur hút l ng v a đ đ c y, nhu m Gram và l u m u trong canh thang.

2. t khuyên c y và sau khi đ ngu i c y zig zag trên môi tr ng CA, làm t ng t v i các môi tr ng BA, BCP.

3. các đ a môi tr ng:

 CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .

 BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .

Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi , tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ .([2])

V.3.4 c đi m khu n l c c a S.aureus trên môi tr ng nuôi c y phân l p và nhu m Gram: nhu m Gram:

C u khu n Gram d ng đ ng riêng l , t ng đôi, 4 t bào hay d ng chùm nho, trong l a c y già thành gram âm, không di đ ng, không t o bào t . Trên môi tr ng không ch n l c, khu n l c Staphylococci th ng có đ ng kính 1-3mm sau 24h/350C-370C, nhi t đ phòng (200C-250C) là t t nh t đ ti t s c t . Khu n l c màu tr ng đ c không s c t hay có s c t t vàng kem đ n vàng cam. S.aureus là vi khu n d nuôi c y, phát tri n nhi t đ 100C-450C và n ng đ mu i t i 10%. Trên môi tr ng th ch th ng t o khu n l c d ng S (đ ng kính 1- 2mm). Sau 24h/35-370C, khu n l c th ng có màu vàng chanh.Trên canh thang, làm đ c môi tr ng, l ng c n khi đ lâu.([22])

Trên BA, t o khu n l c tròn, nh , màu tr ng đ c, bóng, l i và tan máu Trên BCP, t o khu n l c tròn, nh , màu vàng kem, bóng, l i và làm môi tr ng đ i màu t tím Trên CA, t o khu n l c

Một phần của tài liệu Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm máu và mủ tại Bệnh viện Nhi Đồng 2 từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 04 năm 2014 (Trang 45 - 92)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(92 trang)