IV. 1B nh p hm
V.2.1.2.2 Ph ng pháp
Chu n b : T m bông vô trùng L y m u:
D a vào m ng i ta chia làm 2 lo i:
1. m đã v (bao g m v t th ng h có m ): - Lau s ch vùng da xung quanh v i c n 70%
- Lau s ch m trên v t th ng b ng g c vô trùng th m n c mu i sinh lý - Dùng t m bông đã th m n c mu i sinh lý đ l y b nh ph m
*N u v t th ng b nhi m trùng, c t l c vùng mô d i l p m đã lau s ch, n n n m , dùng t m bông vô trùng đ th m sau đó cho vào l vô trùng
2. m kín:
- Sau khi sát trùng vùng da bên ngoài, đ khô, ch c kim hút l y m ho c d ch b m vào l vô trùng
- L y đ c nhi u m : b m vào l vô trùng
- L y đ c ít m : hút thêm Nacl sau đó cho vào l vô trùng
V i m m i, khi hút thì b m NaCl vào, sau đó hút l i, cho vào l vô trùng V.2.1.2.3 V t li u l y và chuyên ch
V t li u l y m u: T m bông vô trùng Chuyên ch :
- Chai c y máu: b o qu n t 2-250C
- M u m sau khi l y chuy n đ n khoa Vi sinh càng s m càng t t và ph i đ c x lý trong vòng 2h sau khi l y m u. B o qu n nhi t đ th ng khi v n chuy n.([22])
V.3 Qui trình nuôi c y phân l p và xác đnh S.aureus: V.3.1 Nguyên t c: V.3.1 Nguyên t c:
- Phân l p hay tách r i vi khu n t m t h n h p d a trên nguyên t c làm c n d n m m c y.
- Các vi khu n s m c tùy theo t ng lo i môi tr ng và nhi t đ .
-D a vào khu n l c đ c tr ng t đó đ nh danh vi sinh v t b ng các ph n ng sinh hóa chuyên bi t, ng ng k t.
- Làm kháng sinh đ b ng ph ng pháp đa gi y khuy ch tán kháng sinh trong th ch MHA.([23])
V.3.2 Nh n và đ ng kí m u
B nh ph m là: máu và m đ c g i t các khoa lâm sàng đ n khoa vi sinh t i b nh vi n nhi ng II t tháng 11/2012 đ n tháng 1/2013.
Thông tin v đ tu i, gi i tính đ c ghi vào phi u xét nghi m.
Có s liên h ch t ch gi a khoa đi u tr và phòng vi sinh đ ghi nh n thông tin đ y đ
và chính xác. ([22])
V.3.3 Quy trình nuôi c y, phân l p:
V.3.3.1 C y máu:
V.3.3.1.1 Kh o sát vi th
1. t chai c y máu vào trong máy c y máu
2. Khi máy c y máu báo d ng: l y chai d ng ra kh i máy, ki m tra mã code trên chai và phi u xét nghi m xem có s trùng kh p hay không
3. L y chai c y máu d ng ti n hành nhu m Gram, soi t i và c y:
Sát khu n chai c y máu b ng c n 70% đ khô, b t đèn gas ho c đèn c n, h l a đ u chai và l c đ u.
Dùng kim tiêm vô trùng đâm vào đ u chai và l y m t l ng máu đ đ : soi t i, nhu m Gram và c y vào 3 môi tr ng BA, CA, BCP (c y ria)
* C y:
- Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi trong t m, t CO2 kho ng 18-24h, tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ
- các đ a môi tr ng:
CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .
BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .
ng SAD (1 ng nhi t đ phòng/18-24 gi , 1 ng 370C/18-24 gi ) * Soi t i và nhu m Gram:
- Chu n b 2 lame kính vô trùng
+ Lame 1: nh m t gi t máu đ soi t i (soi t i đ quan sát s di đ ng và hình d ng vi khu n)
+ Lame 2: nh m t gi t máu và tr i đ u thành m t ph t 2-3 cm/lame. khô t nhiên sau đó h nh qua ng n l a đèn c n đ c đnh m u.
- Nhu m Gram:
* N u nhu m Gram th y:
- N m: chuy n vào 2 ng SAD (c y ria trên th ch nghiêng)
- Tr c khu n gram âm nh ng n (nghi ng Gaemophilus) v ch 1 đ ng t c u lên h p th ch BA sau khi c y b nh ph m
- C u khu n Gram d ng đôi chu i: đ t thêm đa kháng sinh Optochin và Bacitracin lên h p BA. Theo dõi và làm kháng sinh đ n u th y vi khu n m c (k t qu nhu m soi th y thu n 1 lo i vi khu n)
V.3.3.2 C y m :
V.3.3.2.1 Kh o sát đ i th : màu s c, đ đ c, mùi Màu s c: đ , vàng, xanh lá, nâu đ , h ng…
D ch hút abces gan (th ng do amip): đ c, nâu s m ho c vàng nh t
M t v t th ng sau ph u thu t ho c ch n th ng, b ng: xanh lá (th ng do
P.aeruginosa)
Mùi: th i, tanh, h ng…
Hôi: do vi khu n k khí ho c h n h p hi u, k khí
M u b nh ph m có mùi v i k t qu nhu m Gram: báo cho lâm sàng đ đ nh h ng s
S đ 1: QUY TRÌNH C Y MÁU BACTEC (+) Nhu m Gram: -B t màu gram -Hình d ng, cách s p x p -BCP ( t th ng) - 2 ng SABOURAUD (1 nhi t đ phòng, 1 t m) -BA, CA ( t CO2)
Báo cáo ngay cho lâm sàng: -Hình d ng: Cocci ho c Baci -Gram (+) ho c Gram (-)
nh danh KS
- nh danh: Làm tr c nghi m sinh hóa, api, ng ng k t
Theo k t qu nhu m Gram và đ c khóm trùng sau khi c y
C y
Khóm trùng
Tính ch t: l ng, đ c, nh y, có l n máu…
Mù ng t c : có h t l u hu nh màu vàng, b nh vùng m t c do Actinomyces
Chi d i, m abces: ch a h t nh nhi u màu ( đen, đ …) là do u n m ho c u h t M abces l nh do lao: gi ng phomat ho c bã đ u
V.3.3.2.2 Kh o sát vi th :
- S d ng que ph t l y m (c y tr c làm lam nhu m sau) l n nh nhàng trên 3 môi tr ng CA, BA, BCP và lam đã kh trùng, không c xát ho c quá áp sát
- Nhu m gram.([22]) M Nhu m Gram Báo cáo K t qu s b cho lâm sàng Ch K t qu c y Không có vi khu n ho c đa nhi m C y: -BA, CA ( t CO2) -BCP ( t th ng) -SABOURAUD nh danh: Tr c nghi m sinh hóa, ng ng k t, api, huy t thanh, kháng sinh đ S đ 2: QUY TRÌNH C Y M c khóm trùng N u có vi khu n thu n khi t
Nhu m Gram
Nguyên t c
Do s khác bi t v c u trúc t bào, vi khu n Gram d ng s gi đ c ph c h p màu tím Getian-iode và không b t y màu b i alcool trong khi vi khu n Gram âm không gi đ c ph c h p này.
Cách ti n hành [14]
A.T o phi n ph t
Ghi tên m u ho c s nh n di n trên lam (lam ph i s ch và khô).
Dùng vòng c y l y m t vòng c y đàm (ch n vùng nh y m ), n u l ng l y 2-3 khuyên tr i đ u trên mi ng lam 1x2 cm, đ khô t nhiên.
C đnh b ng cách dùng c n tuy t đ i ho c đ a nh nhàng lam kính c t ngang ng n l a
đèn c n 2-3 giây tránh làm quá nóng. B.K thu t nhu m
t lam đã ph t m u lên giá đ ng.
Nh vài gi t Crystal violet cho ph đ u lên b m t ph t nhu m và đ yên trong 1 phút. b dung d ch Crystal violet và r a s ch lam kính t t , nh nhàng b ng n c máy. Lugol cho ph trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1 phút.
R a l i lam b ng n c máy t t và nh nhàng.
T y màu b ng cách c m m t đ u lam và nh t t Alcohol 95% ho c Alcohol– Acetol lên ph t nhu m cho đ n khi vùng phi n kính b c màu đi (thông th ng là t 10 đ n 15 giây).
R a nhanh b ng n c (m s n vòi n c tr c khi b t đ u kh màu).
Nh vài gi t Safrafin cho ph đ u lên trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1phút.
R a nhanh b ng n c nh nhàng và đ khô t nhiên và quan sát d i kính hi n vi v t kính d u ×100 (v t kính ×10), tìm vùng nh y nh t r i ghi nh n s l ng t bào v y (là các t bào có góc c nh) và các t bào b ch c u hay t bào m (là các t bào tròn nh h n, n đ m màu trên toàn t bào).Vi khu n Gram d ng b t màu tím, Gram âm b t màu h ng. ([2])
C y phân l p
Nguyên t c
Ph ng pháp c y phân l p tách riêng bi t t ng t bào vi sinh v t trên môi tr ng nuôi c y. T m t t bào ban đ u sau m t th i gian nuôi c y s t o ra m t khóm hay khu n l c.
Qui trình
1. V i m u máu: Sau khi sát trùng chai c y máu Batec, s d ng kim tiêm rút l ng máu v a đ đ c y, nhu m gram và soi t i.
V i m u m : - Nh ng m u có que gòn thì dùng que gòn l n đ u trên các h p th ch và lam kính, sau đó ngâm que gòn vào canh thang l u m u.
- Nh ng m u m d ng d ch thì dùng Pipet pasteur hút l ng v a đ đ c y, nhu m Gram và l u m u trong canh thang.
2. t khuyên c y và sau khi đ ngu i c y zig zag trên môi tr ng CA, làm t ng t v i các môi tr ng BA, BCP.
3. các đ a môi tr ng:
CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .
BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .
Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi , tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ .([2])
V.3.4 c đi m khu n l c c a S.aureus trên môi tr ng nuôi c y phân l p và nhu m Gram: nhu m Gram:
C u khu n Gram d ng đ ng riêng l , t ng đôi, 4 t bào hay d ng chùm nho, trong l a c y già thành gram âm, không di đ ng, không t o bào t . Trên môi tr ng không ch n l c, khu n l c Staphylococci th ng có đ ng kính 1-3mm sau 24h/350C-370C, nhi t đ phòng (200C-250C) là t t nh t đ ti t s c t . Khu n l c màu tr ng đ c không s c t hay có s c t t vàng kem đ n vàng cam. S.aureus là vi khu n d nuôi c y, phát tri n nhi t đ 100C-450C và n ng đ mu i t i 10%. Trên môi tr ng th ch th ng t o khu n l c d ng S (đ ng kính 1- 2mm). Sau 24h/35-370C, khu n l c th ng có màu vàng chanh.Trên canh thang, làm đ c môi tr ng, l ng c n khi đ lâu.([22])
Trên BA, t o khu n l c tròn, nh , màu tr ng đ c, bóng, l i và tan máu Trên BCP, t o khu n l c tròn, nh , màu vàng kem, bóng, l i và làm môi tr ng đ i màu t tím Trên CA, t o khu n l c
tròn, nh , màu tr ng
đ c, bóng, l i
S đ 3: Quy trình đ nh danh S.aureus
M u b nh ph m
Nhu m Gram: c u khu n Gram d ng x p đôi, t c u, chùm nho
C y trên môi tr ng t ng ng cho t ng lo i b nh ph m
Nhu m Gram: c u khu n Gram d ng x p đôi, t c u, chùm nho
Micrococcaceae
Ch n khu n l c:
- BCP: tr ng đ c đ n vàng chanh - BA: tròn, t, bóng nh y, tan
ho c không tan máu
Streptococcaeae Di đ ng Catalase Stomatococcus Oxidase Planococcus Micrococcus Staphylococci Nacl 6.5% Coagulase S.aureus SCN (-) (+) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (+)
V.4 Thí nghi m đ d nh danh S.aureus:
Chapman Coagulase Urease ODC
+ + V - Chú thích: +: h n 90% ch ng cho k t qu d ng tính. -: h n 90% ch ng cho k t qu âm tính. V: 11-89% ch ng cho k t qu d ng tính. ([22]) V.4.1 Chapman: 1/ M c đích:
Th nghi m lên men manitol dùng đ phân bi t S.aureus v i các ch ng Staphylococci
khác.
2/ Nguyên t c:
S.aureus lên men đ c đ ng mannitol trong môi tr ng Mannitol salt agar ch a 7.5% NaCl (hay còn g i là Chap man) làm thay đ i pH6.8 môi tr ng chuy n sang màu vàng. Các ch ng Staphylococci khác không lên men Manitol nên môi tr ng s gi màu đ .
3/ Môi tr ng
Môi tr ng Chapman, ch th màu Phenol red, pH ả6,8. 4/ Thao tác
Hút 1ml n c c t vào tube vô trùng.
Ch n khu n l c đ c tr ng cho S.aureus, dùng pipet l y 3-4 khu n l c đ c tr ng cho vào tube vô trùng. L c đ u.
Hút huy n d ch vi khu n vào pipet nh lên b m t ng th ch nghiêng. y n p ng nghi m nh ng không đ y ch t.
370C, 18-24h.
5/ K t qu
(+): chuy n t màu đ sang vàng có lên men mannitol. (-): v n gi nguyên màu l c, không lên men mannitol. ([22])
V.4.2 Coagulase:
1/ M c đích:
Th nghi m Coagulase dùng đ phân bi t S.aureus v i các Staphylococci khác
2/ Nguyên t c:
Enzym coagulase có 2 d ng: coagulase liên k t và coagulase t do (lo i coagulase liên k t đ c xác đnh b ng k thu t trên kính, còn lo i coagulase t do đ c xác đnh b ng k thu t trong ng nghi m), đ c phát hi n khi g p huy t t ng t o l n c n ho c làm đông huy t t ng
S.aureus có enzyme coagulase có kh n ng gây đông huy t t ng th
3/ Môi tr ng:
Huy t t ng th đông khô
4/ Thao tác
L y 1ml NaCl cho vào tube huy t t ng th đông khô, l c nh đ tr n đ u.
L y 1ml NaCl cho vào tube vô trùng ch n khu n l c đ c tr ng cho S.aureus, dùng pipet l y 3-4 khu n l c đ c tr ng cho vào tube vô trùng. L c đ u.
Hút huy n d ch vi khu n vào pipet cho vào tube ch a huy t t ng th . L c nh đ
tr n đ u.
370C, 18-24h.
(-): không đông huy t t ng th k t lu n là Staphylococci coagulase negative
(SCN). ([22])
V.5 K thu t xác đnh tính nh y c m kháng sinh c a S.aureus: V.5.1 Th c hi n ph ng pháp kháng sinh đ Kirby Bauer V.5.1 Th c hi n ph ng pháp kháng sinh đ Kirby Bauer
V.51.1 Nguyên t c
Kháng sinh đ c t m vào gi y theo n ng đ cho t ng lo i. Kháng sinh s khu ch tán chung quanh m t th ch môi tr ng nuôi c y. ng kính vòng vô khu n b c ch di n đ t tính nh y c m c a vi khu n đ i v i kháng sinh.
Ph ng pháp này đ c y Ban Qu c Gia v các Chu n M c Phòng Thí Nghi m Lâm Sàng CLSI-2012 ch p thu n và bi n lu n theo CLSI.
V.5.2 Cách ti n hành.
V.5.2.1 V t li u.
a gi y t m kháng sinh: đ ng kính 6 mm, t m kháng sinh v i n ng đ
tiêu chu n cho t ng lo i kháng sinh.
Môi tr ng th ch c b n: MHA (Mueller Hinton Agar).
Dung d ch chu n đ đ c 0,5 McFarland.
D ch khu n th nghi m: 1-2 ×108 CFU/ml, t ng đ ng v i đ đ c 0,5 McFarland ho c đo đ h p ph b c sóng 625nm đ t 0,08-0,1.
V.5.2.2 Pha huy n d ch vi khu n
Pha huy n d ch vi khu n có n ng đ 0,5 McFarland. Huy n d ch vi khu n nh v y ch a 1-2×108t bào/ml.
Pha huy n d ch vi khu n tr c ti p t khóm vi khu n.
Ch n ít nh t t 3-5 khóm vi khu n gi ng nhau l y t m t th ch đã nuôi c y t 18-24 gi , cho vào môi tr ng l ng hay trong n c mu i sinh lý NaCl 0,85 %. i u ch nh huy n d ch vi
th c hi n đ c chính xác b c này thì có th dùng quang k hay nhìn b ng m t th ng b ng cách dùng đ ánh sáng đ so sánh tube ch a vi khu n v i tube đ đ c chu n 0.5