3.2.2.1.Nguyên tắc.
- Phương pháp sử dụng mẫu dò ựể phát hiện v sinh vật trong thực phẩm
ựược dựa trên sự phát hiện một ựọan gene ựặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở
của vịec mẫu dò là quá trình lai phân tử.
- Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Qúa trình này bao gồm sự tách rời hai mạch ựôi của chuỗi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt ựộ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xãy ra khi ựoạnmồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vúng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển ựộng nhiệt và khi nhiệt ựộ
môi trường thấp hơn Tm ắt nhất vài ựộ. Qúa trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng ựộ DNA trong môi trường, nhiệt ựộ và thời gianphản ứng, kắch thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
3.2.2.2. Cách làm.
- Hệ thống này sử dụng que với mẫu dò ựể phát hiện Listeria. Mẫu dò là những ựọan Oligomer DNA ựánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình có thểựược chia làm 6 bước:
Phát vỡ tế bào thu nhận rRNA.
Mẫu dò DNA có ựuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescenin isothiocynate (F) ở ựầu 5Ỗ và 3Ỗcủa phân tử ựược
ựặt vào phản ứng.
Que thử ựược bao bọc bởi polydeoxythydien (dT) ựể gắn kết ựược với oligo dA của mẫu dò
Que thử ựược ựặt vào ống ựo chứa mẫu dò phát hiện ựược ựánh dấu bằng enzyme.
Sau khi rữa, lọai bỏ phần enzyme thừa , que thử ựược ựặt vào ống ựo chứa cơ chất tạo màu.
Sau khi ủựể hiện màu, màu ựược phát hiện ở bước sóng 450nm.
3.2.3.Phương pháp PCR.
3.2.3.1. Nguyên tắc.
- Phương pháp PCR là một phương pháp invitro ựể tổng hợp DNA dựa trên khuôn là môt trình tự DNA ban ựầu, khuyếch ựại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ họat ựộng của enzymepolymerase và môt cặp mồi ựặc hiệu cho ựọan DNA này.
- Toàn bộ quá trình ựược lặp ựi lặp lại 25-30 chu kỳ ựể một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành ha2ng tỷ bản sao trong vòng 3-4 giờ.
3.2.3.2. Cách làm.
Cách xác ựịnh Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F và LM-R.
- Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes.
- Chuẩn bị thắ nghiệm.
Trình tự gen hlyA ựã ựược công bố trên ngân hàng gen.
Phần mềm BLAST dung ựể xác ựịnh trình tự gen ựắch hlyA của Listeria
monocytogenes.
Cặp mồi LM-F và LM-R.
Hóa chất sử dụng ựể tách chiết DNA tổng số.
Phương pháp tiến hành thắ nghiệm cho phản ứng PCR.
Dựa trên trình tự gen hlyA của các chủng Listeria monocytogennes ựược công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R ựược thiết kế bao gồm 20bp/mồi cho sản phẩm PCR 468bp.
- Xác ựịnh tắnh ựặc hiệu của mồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tắnh ựặc hiệu của mồi ựược khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn Listeria moocytogenes và không phải là vi khuẩn Listeria mococytogenes trong phản ứng PCR.
- Phản ứng PCR.
DNA khuôn từ Listeria monocytogenes ựược thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách à làm sạch DNA với chloroform hoặc sử lý nhiệt tế bào ở
1000C trong 10 phút. Tối ưu hóa ựiều kiện PCR về nồng ựộ MG2+ (1 .5-4.0 mM), nồng ựộ mồi (0.1-0.5pmol/mồi) và nồng ựộ dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại). Phản ứng PCR ựược thực hiện với thể tắch hổn hợp 25ml vói chu trình nhiệt gồm 940C/3 phút,( 940C/ 1 phút, 600C/1 phút , 720C/ 1 phút)ừ30 trình, 720C/ 5 phút và 40C/5 phút. đánh giá kết quả trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm.
- Xác ựịnh ựộ nhạy của phương pháp.
Môi trường nuôi cấy qua ựêm của vi khuẩn Listeria monocytogenes là tr6n
môi trường LEB ựược ựịnh lượng, pha loãng với mật ựộ thắch hợp. Ly tâm thu sinh khối 1ml canh trường hòa tan trong 100ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3ml dịch tế bào ựã qua sử lý nhiệt ựược sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. đánh giá kết quả nhờ ựiện di trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm.
- Bộ gen DNA.
Bộ gen DNA của Listeria monocytogenes ựược tách và làm sạch dung là khuôn cho phản ứng PCR khuyết ựại ựoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F và LM-R. Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch cho
PCR ựã ựược thiết kế sẵn. Với mục ựắch thu nhận DNA bản mẫu cho phản
ứng PCR một cách ựơn giản hơn, huyền phù Listeria monocytogenes
ựược sử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút ựể phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng / 1 phút ừ 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. - Xác ựịnh ựiều kiện tối ưu cho phản ứng PCR. Nồng ựộ Mg2+: phản ứng PCR ựược thực hiện ở các nồng ựộ cuối cùng của Mg2+ từ 1.5mM-4.0Mm. Nồng ựộ mồi: PCR ựược thực hiện tại các nồng ựộ mồi khác nhau từ 0.1- 05 pmol.
Dịch tế bào ựược xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn bằng phương pháp ựếm khuẩn lạc. Pha loãng dịch vi khuẩn với các nồng ựộ khác nhau, xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn, 3 ml dịch sinh khối vi khuẩn sau khi sử lý nhiệt dung làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết quả
dương tắnh với mẫu có mật ựộ tế bào 6 ừ 102/ phản ứng tương ứng với mật
ựộ tế bào 2 ừ 104 CFU/ml.
- Ưu ựiểm của phương pháp PCR.
Thời gian cho kết quả nhanh.
Có thể phát hiện những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi tăng sinh là
ựơn giản hop7n và ựôi khi không cần thiết.
Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ nuôi cấy và môi trường phân tắch phức tạp, có thể thực hiện ngay tại hiện trường.
Ít tốn kém về nhân sự, có thể ựược tự ựộng hóa ựể làm giảm chi phắ phân tắch phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.
- Nhược ựiểm của phương pháp PCR.
Sự ức chế hoạt tắnh ủa Tag DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tắnh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.
Mật ựộ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong ựa số trường hợp cần có bước nuối cấy làm giàu ựể có ựược mật
ựộựể phát hiện bằng PCR.
Phương pháp này không phân biệt ựược tế bào sống với tế bào chết. Do vậy , có thể dẫn ựến trường hợp dương tắnh giả do DNA từ tế bào chết . ngược lại, phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào ựã chết của các vi sinh gây bệnh, gây ngộ ựộc thực phẩm.