3.2.1.1. Nguyên tắc.
- Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng giữa một tế
bào(kháng nguyên) vớimột kháng thểñặc hiệu. Tín hiệu của một phản ứng miễn dịh có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể ñã ñược ñánh dấu bằng cách nhuộm hùynh quang, ñồng vị phóng xạ, hay enzyme.
- Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enyme. Nguyên tắc kỹ thuật Elisa là sử dụng kháng thể ñơn dòng hay còn gọi là kháng thể sơ cấp phủ bên ngòai những giếng nhỏ nhằm mục ñích thu giữ ñược phép thu giữ bằng cách sử dụng kháng thể thứ 2 có gắn enzyme phát tín hiệu. Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất ñặc hiệu của enzyme,
phản ứng xãy ra và làm ñổi màu các sản phẩm làm ñổi màu phản ứng.Vì vậy chúng ta có thể phát hiện ñược sự hiện diện của kháng nguyên.
3.2.1.2. Quy trình thực hiện phân tích.
Sơñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes. Thuyết minh quy trình.
Chuẩn bị mẫu.
Tăng sinh lần ñầu : Thêm 25g mẫu vào 225ml dung dịch 3M Listeria Broth (LB), trộn ñều, ủở 36=5-370C/24h. Cho mẫu vào giếng ñể 30 phút, ở 35-370C Thêm phức hợp kháng thể và enzyme Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh lần 1 ở 30- 350C/24h, tăng sinh lần 2 ở 300C/22-24h. Thêm cơ chất, dể khỏang 10 phút ở 20-250C ðọc kết quả
Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml dung dịch tăng sinh lần 1 vào 9.9ml canh FRASER ủở 300C/22-24h.
Cách tiến hành phân tích bằng phản ứng ELISA.
Chuẩn bị: Xử lý nhiệt.
Chuyển 1ml mẫu từ canh Fraser vào 50µl dung dịch phụ trợ mẫu vào
ống ñã ñược dán nhãn, ngâm 15 phút trong nước sôi, ñể nguội. Mở
hộpp Listeria VIA và ñể ở nhiệt ñộ phòng. Mở bao và tháo giếng ra rồi
ñặt ở chân ñế.
Cách tiến hành:
Bước 1:
♦ Cấy mẫu và mẫu ñối chứng, ghi lại vị trí cấy mẫu và dung pipep hút 200µlmẫu và dịch ñối chứng vào giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước mỗi giếng 3 lần.
Bước 2:
♦ Thêm 200µl chất kết hợp vào mỗi giếng, ñậy giếng, ủ ở 35-370C/30 phút.
♦ Rửa: ñổ hết dung dịch trong giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước ở giếng rữa mỗi giếng 4 làn.
Bước 3:
♦ Thêm 200µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ 20-250C/15 phút. Them 20µl dung dịch kết thúc giúp ổn ñịnh màu vào mỗi giếng ( nếu cần).
Bước 4: ðọc kết quả.
♦ ðọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu hoặc sử dụng máy ñọc.
♦ Nếu mẫu có màu xanh lá cây ñến xanh dương ñậm thì mẫu dương tính.