2.2.3.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy mẫu: Mẫu lỏ chựm ngõy được lấy tại cỏc địa điểm: vườn rau hữu cơ Tuệ Viờn Long Biờn- Hà Nội, Việt Yờn- Bắc Giang, Đồng Hỷ -Thỏi Nguyờn. Nờn lấy mẫu vào buổi sỏng, lựa chọn cỏc lỏ bỏnh tẻ, loại bỏ cỏc lỏ vàng, thối.
Bảo quản mẫu: Mẫu lấy về nờn phõn tớch trong thời gian sớm nhất cú thể. Mẫu được phõn tớch càng sớm, độ chớnh xỏc càng cao. Trong trường hợp phải bảo quản thỡ bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.3.2. Quy trỡnh chiết tỏch vitamin C từ lỏ cõy chựm ngõy
Qua nghiờn cứu cỏc tài liệu tham khảo khảo [4], [7], [14 ], [18] và quỏ trỡnh nghiờn cứu thực nghiệm, chỳng tụi xõy dựng quy trỡnh chiết tỏch vitamin C từ lỏ cõy chựm ngõy như sau:
*Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Cõn 50g mẫu lỏ chựm ngõy tươi (mẫu phõn tớch) sạch, nghiền nhỏ bằng mỏy say sinh tố. Sau đú chuẩn bị hệ dung mụi hữu cơ - nước theo tỷ lệ nhất định. Chuyển mẫu phõn tớch đó nghiền nhỏ ở trờn vào cốc thủy tinh 500 mL, thờm vào đú 200mL hệ dung mụi đó chuẩn bị, khuấy đều và ngõm trong 48 giờ nhằm
hũa tan hoàn toàn cỏc hợp chất hữu cơ trong dung mụi hữu cơ. Dịch chiết thu được ký hiệu là DC1.
Bước 2: Tiến hành lọc DC1 bằng bơm hỳt chõn khụng qua giấy lọc. Sau đú cất cụ quay để đuổi bớt dung mụi, thờm nước cất siờu sạch thu được dịch chiết (ký hiệu là DC2) vào phễu chiết.
Bước 3: Thờm vào DC2 50 mL n-hexan, lắc đều hỗn hợp trong 30 phỳt (lặp lại 3 lần) nhằm tỏch loại cỏc tạp chất ớt phõn cực như: chất glocom, dầu bộo, terpen… Sau đú, để yờn cho hỗn hợp phõn lớp, tiến hành chiết tỏch pha, lấy pha phớa dưới (pha nước-ký hiệu là DC3) để tiếp tục thớ nghiệm. Dung mụi n-hexan được chia làm 2 phần và lắc chiết 2 lần, mỗi lần với 25 mL n-hexan.
Bước 4: Chuyển phần DC3 vào eclen, kiềm húa dịch chiết bằng dung dịch KOH 1M nhằm chuyển tất cả axit thành dạng muối natri tan được trong nước, axit húa dịch muối natri bằng dung dịch HCl 1M nhằm chuyển axit dạng muối thành dạng axit tự do (DC4).
Bước 5: Chuyển DC4 vào phễu chiết, tiếp tục thờm vào đú 50mL etylaxetat, lắc đều hỗn hợp trong 30 phỳt nhằm loại bỏ cỏc hợp chất cản trở như flavonoid aglycon, cỏc axit khụng tan, it tan trong nước như phenolic, p-anisic…[4]. Sau đú, để cho hỗn hợp phõn lớp, tiến hành chiết tỏch pha, lấy pha nước phớa dưới (ký hiệu pha này là DC5). Dung mụi etylaxetat được chia làm 2 phần và lắc chiết 2 lần, mỗi lần với 25 mL etylaxetat.
Bước 6: Tiến hành cất cụ quay đuổi hết dung mụi trong DC5 thỡ dừng cất, chuyển hoàn toàn phần dịch sau cụ quay vào bỡnh định mức 50mL, trỏng sạch bỡnh cụ quay rồi định mức bằng nước cất siờu sạch đến vạch định mức (ký hiệu DC6).
Bước 7: Tiến hành định lượng vitamin C trong dịch chiết thu được bằng mỏy phõn tớch cực phổ đa năng 797 VA Computrace trong cỏc điều kiện thớ nghiệm tối ưu đó khảo sỏt.
Hỡnh 2.1. Sơ đồ chiết tỏch vitamin C trong lỏ cõy chựm ngõy
Dịch chiết phõn tớch (DC6)
Dịch chiết trong nước
(DC5)
1.Cất cụ quay để loại bỏ dung mụi 2. Thờm nước cất 2 lần
Dịch chiết trong etylaxetat
Dịch chiết trong nước
(DC4) Dịch chiết trong
n-hexan
Dịch chiết trong nước
(DC3)
Mẫu phõn tớch
(Lỏ chựm ngõy tươi, m = 50 gam)
Nghiền nhỏ, ngõm chiết bằng metaol 90% trong 48 h
Dịch chiết metanol
(DC1)
1.Cất cụ quay để loại bỏ dung mụi 2. Thờm nước cất 2 lần
Dịch chiết trong nước
(DC2)
Lắc, chiết trong n-hexan ( 3 lần)
1. Kiềm húa bằng NaOH 1M 2. Axit húa bằng HCl 1M dư
2.2.3.3. Khảo sỏt ảnh hưởng của hệ dung mụi đến khả năng chiết tỏch vitamin C
Để cú thể tỡm ra được dung mụi chiết tỏch vitamin C tốt nhất, chỳng tụi tiến hành lựa chọn bằng cỏch thực hiện ngõm chiết trong dung mụi khỏc nhau, từ đú tỡm ra dung mụi cú khả năng chiết tỏch tối ưu nhất.
Quỏ trỡnh phõn tớch được thực hiện theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2, dựng dung mụi lần lượt là metanol và etanol.
2.2.3.4. Khảo sỏt ảnh hưởng của tỷ lệ thể tớch giữa pha hữu cơ và pha nước (Vhữu cơ : Vnước) đến khả năng chiết tỏch vitamin C
Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt khả năng trớch ly vitamin C bằng hệ dung mụi hữu cơ- nước với cỏc tỷ lệ khỏc nhau, từ đú tỡm ra hệ dung mụi cú khả năng trớch ly tối ưu nhất.
Quỏ trỡnh phõn tớch được thực hiện theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2, nhưng thay hệ dung mụi hữu cơ – nước theo cỏc tỷ lệ thể tớch giữa pha hữu cơ và pha nước (Vhữu cơ : Vnước) tương ứng là 50 : 50; 60 : 40; 70 : 30; 80 : 20; 90 : 10.
2.2.3.5. Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian ngõm chiết đến khả năng chiết tỏch vitamin C
Để cú thể lựa chọn được thời gian ngõm chiết thớch hợp nhất cho quỏ trỡnh chiết tỏch vitamin C, chỳng tụi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2, dựng hệ dung mụi hữu cơ – nước theo với tỷ lệ Vhữu cơ : Vnước nhất định, ngõm chiết trong cỏc khoảng thời gian là 12h, 24h, 36h, 48h, 60h và 72h.
2.2.3.6. Khảo sỏt ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu và thể tớch hệ dung mụi đến khả năng chiết tỏch vitamin C
Để cú thể lựa chọn được tỷ lệ khối lượng mẫu và thể tớch hệ dung mụi (mmẫu : Vdung mụi) thớch hợp nhất cho quỏ trỡnh chiết tỏch vitamin C, chỳng tụi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2, dựng hệ dung mụi hữu cơ : nước với tỷ lệ nhất định, ngõm chiết trong trong thời gian như nhau, với tỷ lệ khối lượng mẫu nghiờn cứu (g) : thể tớch hệ dung mụi chiết (mL) lần lượt là: 50:100, 50:150, 50:200, 50:250, 50:300, 50:350.
2.2.3.7. Khảo sỏt ảnh hưởng của thể tớch dịch chiết pha hữu cơ (DC1): thể tớch n-hexan đến khả năng chiết tỏch vitamin C
Để cú thể lựa chọn được tỷ lệ thể tớch dịch chiết pha hữu cơ: thể tớch n-hexan (VDC1 : Vn-hexan) thớch hợp nhất cho quỏ trỡnh chiết tỏch vitamin C, chỳng tụi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2, dựng hệ dung mụi hữu cơ : nước với tỷ lệ nhất định, thay đổi tỷ lệ thể tớch VDC1 : Vn-hexan lần lượt là 100:10, 100:20, 100:30, 100:40, 100:50, 100:60.
2.2.3.8. Khảo sỏt ảnh hưởng của thể tớch dịch chiết sau axit húa bằng HCl (DC4) với thể tớch etyaxetat đến khả năng trớch ly vitamin C
Để cú thể lựa chọn được tỷ lệ thể tớch dịch chiết sau axit húa bằng HCl (DC4) : thể tớch etylaxetat (VDC4 : Vetylaxetat) thớch hợp nhất cho quỏ trỡnh chiết tỏch vitamin C, chỳng tụi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ trờn hỡnh 2.2 và cỏc bước tiến hành ở phần 2.2.3.2 dựng hệ dung mụi hữu cơ : nước với tỷ lệ nhất định, thay đổi tỷ lệ thể tớch VDC4 : Vetylaxetat lần lượt là: 100:10, 100:20, 100:30, 100:40, 100:50, 100:60.