Điện cực giọt thủy ngõn treo (HMDE) là một điện cực sử dụng phổ biến nhất trong phương phỏp Von-Ampe hũa tan. Điện cực HMDE là một giọt Hg hỡnh cầu cú kớch thước nhất định được treo trờn đầu của một mao quản thủy tinh cú đường kớnh trong khoảng 0,15 - 0,5 mm. Sau mỗi phộp đo, giọt thủy ngõn bị cưỡng bức rơi ra khỏi mao quản và được thay thế bằng một giọt thủy ngõn mới tương tự.
Ưu điểm của điện cực HMDE là cú quỏ thế hyđro rất lớn (khoảng 1500 mV trong mụi trường kiềm và trung tớnh, 1200 mV trong mụi trường axit) nờn khoảng thế điện hoạt rộng (trong khoảng 0,4V † -2,0V tựy thuộc mụi trường), do đú cú thể sử dụng để xỏc định nhiều kim loại, phi kim cũng như nhiều hợp chất hữu cơ khỏc nhau. Mặt khỏc điện cực HMDE cú cỏc kết quả phõn tớch cú
độ nhạy cao. Tuy nhiờn, điểm hạn chế của điện cực HMDE là khú chế tạo, vỡ rất khú tạo ra cỏc giọt Hg cú kớch thước lặp lại và khụng cho phộp xỏc định cỏc kim loại cú thế hũa tan dương hơn Hg như Ag, Au…..[5], [6], [12], [13].
Qua phõn tớch đặc điểm cấu tạo, tớnh chất của vitamin C và nhận thấy những ưu điểm của phương phỏp Von –Ampe hũa tan. Chỳng tụi lựa chọn phương phỏp này để xỏc định hàm lượng vitamin C.
1.4. Giới thiệu phƣơng phỏp chiết tỏch cỏc hợp chất thiờn nhiờn 1.4.1. Phƣơng phỏp chiết tỏch
1.4.1.1. Khỏi niệm phương phỏp chiết tỏch
Phương phỏp chiết là phương phỏp tỏch một hay một số chất ra khỏi nguyờn liệu dựa vào đặc tớnh của chất cần chiết và dung mụi, là sự phõn bố giữa hai pha khụng trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn tạo cõn bằng lỏng- rắn. Dung mụi phõn cực sẽ tỏch được chất phõn cực cũn dung mụi khụng phõn cực sẽ tỏch chất khụng phõn cực. Khi nguyờn liệu và dung mụi tiếp xỳc với nhau, lỳc đầu dung mụi thấm vào nguyờn liệu, sau đú hũa tan những chất tan cú trong tế bào nguyờn liệu rồi được khuếch tỏn ra ngoài tế bào. Trong chiết xuất sẽ xảy ra một số quỏ trỡnh như khuếch tỏn, thẩm thấu, thẩm tớch, hũa tan ... và chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỉ lệ rắn-lỏng, độ mịn của nguyờn liệu...[11], [16], [18].
Cú nhiều phương phỏp chiết xuất nguyờn liệu, cú thể kể đến là phương phỏp ngõm dầm, phương phỏp ngấm kiệt, phương phỏp đun hoàn lưu, phương phỏp chiết soxhlet...
Trong luận văn này chỳng tụi lựu chọn phương phỏp ngõm kiệt để chiết vitamin C trong lỏ cõy chựm ngõy.
1.4.1.2. Chiết pha lỏng
+ Khỏi niệm về chiết pha lỏng
Chiết lỏng- lỏng là quỏ trỡnh tỏch chất hũa tan bằng một chất lỏng khỏc (dung mụi) khụng hũa tan. Quỏ trỡnh trớch ly chất lỏng gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn đầu: là giai đoạn trộn lẫn, phõn tỏch 2 pha vào với nhau để tạo sự tiếp xỳc pha tốt cho dung chất truyền từ hỗn hợp đầu vào dung mụi. Nếu thời gian tiếp xỳc pha đủ thỡ quỏ trỡnh truyền vật chất xảy ra cho đến khi đạt cõn bằng giữa hai pha.
Giai đoạn kế tiếp: là giai đoạn tỏch pha, hai pha tỏch ra dễ dàng hay khụng tựy thuộc vào sự sai biệt khối lượng riờng giữa hai pha. Một pha là pha trớch gồm chủ yếu dung mụi và dung chất, một pha gọi là pha rafinat gồm chủ yếu phần cũn lại của hỗn hợp ban đầu. Thường thỡ cỏc cấu tử trong hỗn hợp và dung mụi đều ớt nhiều hũa tan vào nhau vỡ thế trong hai pha đều cú sự hiện diện của cả ba cấu tử [11], [16], [18].
+ Một số kỹ thuật trong chiết pha lỏng
Chiết pha lỏng để hũa tan tất cả hoặc một phần nền mẫu được sử dụng rộng rói. Cỏc kỹ thuật này cú thể ỏp dụng cho cỏc chất bay hơi, chất lỏng và rắn. Quỏ trỡnh chiết pha lỏng thụng thường khụng phải là quỏ trỡnh liờn tục với cõn bằng đạt được giữa hai pha khụng trộn lẫn hoặc là một quỏ trỡnh liờn tục dưới những điều kiện mà cõn bằng khụng nhất thiết phải đạt được. Cỏc kỹ thuật thường được sử dụng trong chiết pha lỏng đú là:
* Kỹ thuật chiết pha lỏng khụng liờn tục
Trong kỹ thuật chiết pha lỏng khụng liờn tục hiệu quả của một dung mụi chiết phụ thuộc chủ yếu vào ỏi lực của chất tan với dung mụi chiết (hằng số phõn bố KD), tỷ số pha (V= pha huu co
pha nuoc
V
V ) và số lần chiết (n). Với một quỏ trỡnh chiết khụng liờn tục đơn giản, KD càng lớn thỡ hiệu suất chiết càng cao. Trong một số trường hợp cú thể nhận được giỏ trị KD mong muốn bằng cỏch điều chỉnh pH để ngăn chặn sự ion húa của cỏc axớt hoặc bazơ, bằng cỏch tạo cỏc cặp ion với cỏc chất tan ion húa, hoặc tạo cỏc phức kỵ nước với cỏc ion kim loại hoặc thờm cỏc muối trung tớnh vào pha nước để giảm độ hũa tan của chất tan hữu cơ. Với cỏc mẫu nhiều hợp phần thỡ một dung mụi chiết là khụng đủ để chiết tất cả cỏc hợp phần do cú sự phõn biệt đối xử và vỡ vậy làm thay đổi quỏ trỡnh phõn tớch. Tuy nhiờn sự phõn biệt đối xử này cú thể cú ớch nếu dung mụi đối xử phõn biệt với cỏc chất khụng cần quan tõm trong quỏ trỡnh phõn tớch [11], [16], [17].
* Kỹ thuật chiết pha lỏng liờn tục
Kỹ thuật chiết pha lỏng liờn tục được sử dụng khi thể tớch mẫu lớn, hằng số phõn bố nhỏ hoặc tốc độ chiết chậm. Nhỡn chung, cỏc chất chiết lỏng – lỏng nhẹ
hơn hoặc nặng hơn nước sẽ được đun sụi, ngưng tụ và lọc liờn tục với một dung mụi khụng trộn lẫn tương ứng và cú thể hũa tan mẫu.
Quỏ trỡnh chiết pha lỏng liờn tục với cỏc mẫu rắn sẽ được tiến hành bằng chiết Soxhlet. Nguyờn tắc làm việc của thiết bị chiết là mẫu nghiền nhỏ được đựng trong ống chiết mẫu và được đặt vào trong ống chiết Soxhlet. Dung mụi chiết thường là dung mụi hữu cơ đựng trong bỡnh cầu, thể tớch dung mụi thường từ 300 – 400mL ứng với bỡnh cầu 500mL. Dung mụi sẽ được làm bay hơi, ngưng tụ và lọc thấm qua mẫu rắn trong thiết bị chiết. Cỏc chất phõn tớch nằm trong mẫu sẽ được chiết sang pha dung mụi hữu cơ theo định luật phõn bố. Khi dung mụi dõng lờn đến vạch thụng của ống, toàn bộ dung mụi khi đú đó chứa một phần chất phõn tớch được rỳt xuống dưới bỡnh cầu. Cứ liờn tục như vậy, dung mụi được bay hơi lờn, ngưng tụ và chất phõn tớch được phõn bố vào dung mụi chiết. Sau một thời gian nhất định, chất phõn tớch sẽ nằm trong dung mụi ở bỡnh cầu.
Kỹ thuật chiết này cú ưu điểm là chiết triệt để, tuy nhiờn thời gian chiết tương đối dài, và khụng sử dụng cho cỏc chất kộm bền nhiệt [11], [16], [18].
1.4.1.3.Chiết rắn-lỏng
Chiết rắn-lỏng là quỏ trỡnh hũa tan chọn lựa một hay nhiều cấu tử trong chất rắn bằng cỏch cho chất rắn tiếp xỳc với dung mụi.
Quỏ trỡnh trớch ly chất rắn phụ thuộc vào cấu tạo bề mặt và kớch thước của chất rắn. Nhiệt độ trớch ly càng cao càng tốt vỡ nhiệt độ cao làm tăng độ hũa tan của dung chất vào dung mụi, làm giảm độ nhớt do đú làm tăng hệ số khuếch tỏn và tăng tốc độ quỏ trỡnh trớch ly. Tuy nhiờn với sản phẩm tự nhiờn, nhiệt độ trớch ly quỏ cao cú thể làm tăng độ hũa tan của cỏc chất khụng mong muốn vào dung dịch.
Quỏ trỡnh trớch ly chất rắn cú thể thực hiện giỏn đoạn, bỏn liờn tục hoặc liờn tục. Trong mỗi trường hợp quỏ trỡnh cú thể là tiếp xỳc pha theo bậc hoặc tiếp xỳc pha liờn tục. Cú 2 phương phỏp để tạo sự tiếp xỳc pha là phun tưới chất lỏng qua lớp vật liệu rắn hoặc nhỳng chất rắn chỡm hoàn toàn trong chất lỏng. Việc lựa chọn thiết bị trong một trường hợp bất kỳ phụ thuộc phần lớn trờn trạng thỏi vật lý của chất rắn và dung chất trong chất rắn [11], [16], [17].
1.4.2. Cỏc yếu tố ảnh hƣởng đến quỏ trỡnh chiết xuất cỏc hợp chất thiờn nhiờn
1.4.2.1. Những yếu tố thuộc về dung mụi
Dung mụi dựng để trớch ly phải hũa tan cỏc chất cần trớch ly. Cỏc loại dung mụi khỏc nhau cú khả năng trớch ly khỏc nhau. Hiệu suất trớch ly cũn tựy thuộc vào tỷ lệ hàm lượng dung mụi so với nguyờn liệu. Tỷ lệ này càng cao thỡ dung dịch trớch ly càng nhiều. Hệ dung mụi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu suất trớch ly [11], [18].
* Yờu cầu đối với dung mụi trớch ly
+ Hũa tan chọn lọc, nghĩa là chỉ hũa tan cỏc cấu tử cần trớch ly, khả năng hũa tan càng lớn càng tốt, nhưng ớt hũa tan cỏc cấu tử khỏc;
+ Khối lượng riờng phải khỏc xa khối lượng riờng của hỗn hợp nguyờn liệu ban đầu;
+ Cú hệ số khuếch tỏn lớn đảm bảo cho tốc độ chuyển khối lớn; + Độ bay hơi càng lớn càng tốt;
+ Nhiệt dung riờng và ẩn nhiệt húa hơi càng bộ càng tốt;
+ Dung mụi cần cú tớnh bền về húa học. Độ nhớt, ỏp suất hơi và điểm đụng đặc phải thấp. Khụng độc, khụng gõy chỏy và giỏ thành thấp [11], [18].
* Độ phõn cực của dung mụi
Núi chung dung mụi ớt phõn cực dễ hũa tan cỏc chất khụng phõn cực và khú hũa tan cỏc chất cú nhiều nhúm phõn cực và ngược lại.
Dựa vào độ phõn cực của dung mụi người ta phõn loại như sau:
+ Dung mụi khụng phõn cực: ether dầu hỏa, hexan, benzene, toluen…
+ Dung mụi phõn cực yếu và vừa: chloroform, etylaxetat diclorethan, aceton… + Dung mụi phõn cực mạnh: nước, methanol, ethanol, isopropanol…[11], [16], [18].
* Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung mụi
Dung mụi cú độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thỡ dung mụi dễ thấm vào nguyờn liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quỏ trỡnh chiết xuất và ngược lại.[11], [18].
1.4.2.2. Những yếu tố thuộc về thụng số kỹ thuật
* Nhiệt độ chiết xuất
Theo lý thuyết khi nhiệt độ tăng và hệ số khuếch tỏn lớn thỡ quỏ trỡnh chiết xuất sẽ thuận lợi hơn. Nhưng trờn thực tế đụi khi lại đi ngược lại là do:
+ Đối với những hợp chất kộm bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ tăng cao sẽ gõy phỏ hủy một số hoạt chất như vitamin, glycoside, alkaloid…
+ Đối với tạp chất: Khi nhiệt độ tăng, độ hũa tan của tạp chất cũng tăng theo,dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp.
+ Đối với dung mụi dễ bay hơi cú nhiệt độ sụi thấp: Khi nhiệt độ tăng cao thỡ dung mụi dễ bị hao hụt, khi đú đũi hỏi thiết bị phải kớn và phải cú bộ phận hồi lưu dung mụi.
+ Đối với một số chất cú quỏ trỡnh hũa tan tỏa nhiệt: Khi nhiệt độ tăng, độ tan của chỳng lại bị giảm. Do đú để tăng độ tan thỡ cần phải làm giảm nhiệt độ [11], [18].
* Thời gian chiết xuất
Khi bắt đầu chiết, cỏc phõn tử cú phõn tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được khuếch tỏn và hũa tan vào dung mụi trước, sau đú mới đến cỏc chất cú phõn tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo…). Do đú nếu thời gian chiết ngắn sẽ khụng chiết được hết hoạt chất trong nguyờn liệu, nhưng nếu thời gian chiết dài quỏ, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gõy bất lợi cho quỏ trỡnh tinh chế và bảo quản [11], [17].
* Độ mịn của nguyờn liệu
Nguyờn liệu càng xay nhỏ, diện tớch tiếp xỳc bề mặt với dung mụi càng lớn, quỏ trỡnh chiết xuất càng nhanh. Nhưng trong thực tế, nếu nguyờn liệu nghiền quỏ mịn lại khụng cú lợi do:
+ Tế bào khi bị phỏ vỡ, nhiều chất khú tan như chất keo sẽ làm cho dịch chiết chứa nhiều tạp chất khú loại, khú lọc.
+ Dung mụi khú tiếp xỳc được với nguyờn liệu để tiến hành cỏc quỏ trỡnh khuếch tỏn, thẩm thấu chất cần chiết. Đụi khi dung mụi cũn tạo với nguyờn liệu thành một khối rất khú xử lý [11], [18].
* Khuấy trộn
Để tăng cường quỏ trỡnh khuếch tỏn chất tan vào dung mụi, cần phải tạo ra chờnh lệch nồng độ bằng cỏch di chuyển lớp dịch chiết ở phớa sỏt màng tế bào (nơi
cú nồng độ cao hơn) ra phớa xa hơn và di chuyển lớp dung mụi ở phớa xa (nơi cú nồng độ thấp hơn) đến sỏt màng tế bào. Điều này được thực hiện bằng cỏch khuấy trộn. Tựy từng trường hợp cụ thể mà người ta chọn cấu tạo cỏnh khuấy và tốc độ khuấy sao cho phự hợp [11], [18].
1.5. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về cõy chựm ngõy ở trong nƣớc và trờn thế giới
Chựm ngõy được xem là một cõy đa cụng dụng, rất hữu ớch tại những quốc gia nghốo. Vỡ vậy nú được nghiờn cứu rất nhiều về trồng trọt và thu hỏi; cũng như nghiờn cứu về cỏc hoạt tớnh y dược học và giỏ trị dinh dưỡng. Đa số cỏc nghiờn cứu được thực hiện tại Ấn Độ, Philippines và Phi Chõu.
1.5.1.Trờn thế giới
1.5.1.1. Hoạt tớnh khỏng nấm gõy bệnh
Nghiờn cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Taiwan) ghi nhận dịch chiết từ lỏ và hạt chựm ngõy bằng ethanol cú cỏc hoạt tớnh diệt được nấm gõy bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum và Microsporum canis. Rễ chựm ngõy cú hoạt tớnh khỏng khuẩn và chứa nhiều cỏc hợp chất khỏng khuẩn. Yếu tố khỏng vi sinh vật là pterygospermin, cú hoạt tớnh khỏng khuẩn và khỏng nấm mạnh [25].
1.5.1.2. Tỏc dụng của quả chựm ngõy trờn cholesterol và lipid trong mỏu
Nghiờn cứu tại ĐH Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) về hoạt tớnh trờn cỏc thụng số lipid của quả chựm ngõy. Kết quả cho thấy quả chựm ngõy cú tỏc dụng gõy hạ cholesterol, phospholipid, triglyceride, hạ tỷ số cholesterol/ phospholipid trong mỏu [30].
Metyl phydroxybenzoat và β-sitosterol trong quả chựm ngõy đó được nghiờn cứu và chứng minh là cú hoạt tớnh làm giảm huyết ỏp [32].
1.5.1.3. Cỏc hoạt tớnh chống co thắt và bảo vệ gan
Trung Tõm Nghiờn cứu Kỹ Thuật (CEMAT) tại Guatamala City đó ngiờn cứu về hoạt tớnh chống co thắt của dịch chiết cồn lỏ chựm ngõy là do sự cú mặt của hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]-o-metyl thiocarbamat [30]. Đõy là cơ sở để lý giải vỡ sao lỏ chựm ngõy được dựng để chữa bệnh tiờu chảy trong y học dõn gian.
1.5.1.4. Cỏc chất gõy đột biến gen từ hạt chựm ngõy rang chớn
Một số cỏc hợp chất cỏc chất gõy đột biến gen đó được tỡm thấy trong hạt chựm ngõy rang chớn: Cỏc chất quan trọng nhất được xỏc định là 4 (α - Lrhamnosyloxy); phenylacetonitril; 4-hydroxyphenylacetonitril và 4- hydroxyphenyl-acetamid [14].
1.5.1.5. Khả năng ngừa thai của rễ Chựm Ngõy
Nghiờn cứu tại ĐH Jiwaji, Gwalior (Ấn độ) về cỏc hoạt tớnh estrogenic, khỏng estrogenic, ngừa thai của nước chiết từ rễ chựm ngõy [38].
1.5.1.6. Hoạt tớnh khỏng khuẩn của hạt chựm ngõy
Trường Đại học San Carlos ở Guatemala đó tỡm ra một loại khỏng sinh cú tỏc dụng như neomycin cú khả năng bảo vệ da khỏi sự viờm nhiễm do Staphylococcus aureus. Loại khỏng sinh này là một hỗn hợp khỏng khuẩn và nấm cú tờn pterygospermin, danh phỏp húa học là glucosinolat 4- (α-L-Rhamnosyloxy) benzyl trớch từ hạt chựm ngõy [30].
1.5.1.7. Hoạt tớnh khỏng khối u và ung thư
Vào năm 1980, Dhawan và cộng sự [14] đó nghiờn cứu dịch chiết bằng cồn của cõy, rễ chựm ngõycú tớnh khỏng ung thư biểu mụ mũi hầu, trờn mụ cấy và tế bào lymphụ P388 của ung thư bạch cầu của chuột.
Makonnen và cộng sự đó phỏt hiện lỏ chựm ngõy cú tiềm năng chống khối u. Hợp chất o- etyl- 4- [α-L-rhamnosyloxy] benzyl carbamat cựng với 4 [α-L- rhamnosyloxy]- benzyl isothiocyanat, niazimicin và 3- O- [6′- O- oleoyl- α- D- glucopyranosyl]- β- sitosterol đó được khảo sỏt hoạt tớnh chống khối u, sử dụng mụ hỡnh phõn tớch in vitro [27], [31].
1.5.1.8. Hoạt tớnh của Rễ chựm ngõy trờn Sạn thận loại Oxalate:
Thử nghiệm tại Đại Học Dược K.L.E.S, Nehru Nagar, Karnakata (Ấn Độ) trờn chuột bị gõy sạn thận, oxalate bằng etylen glycol ghi nhận dịch chiết bằng nước và ancol từ rễ cựng lừi gỗ chựm ngõy làm giảm rừ rệt nồng độ oxalate trong nước tiểu bằng cỏch can thiệp vào sự tổng hợp oxalate trong cơ thể. Sự kết đọng tạo sạn trong thận cũng giảm rất rừ khi cho chuột dựng dịch chiết này như một biện phỏp phũng ngừa bệnh sạn thận [38], .
1.5.2. Tại Việt Nam