2.3.1. Phương pháp tách chiết và làm giàu PCB
Trong phân tích các hợp chất hữu cơ nói chung và PCB nói riêng, giai đoạn tách chiết, làm sạch, làm giàu mẫu phân tích luôn đƣợc đề cao, đóng vai trò quyết định và đòi hỏi ngƣời phân tích cần lựa chọn, đƣa ra những phƣơng pháp phù hợp nhất. Có nhiều cách để tách chiết các hợp chất PCB ra khỏi nền mẫu môi trƣờng. Hiện nay, một số kỹ thuật đang sử dụng chiết soxlet; chiết siêu âm; chiết vi sóng (MAE); chiết siêu tới hạn (SFE); chiết dung môi liên tục (ASE); chiết lỏng-lỏng (LLE)... Mẫu sau khi chiết đƣợc làm sạch và tách phân đoạn trên các cột hấp phụ
24 dạng thƣơng phẩm hoặc cột nhồi nhƣ florisil, silicagel, than hoạt tính, nhôm ôxít. Tùy thuộc vào loại và lƣợng mẫu khác nhau mà lựa chọn các kỹ thuật chiết, làm sạch mẫu cho phù hợp và hiệu quả.
Phương pháp tách chiết, làm giàu PCB trong mẫu đất, trầm tích
Chiết soxlet đƣợc sử dụng để tách lƣợng vết các đồng loại PCB trong nền mẫu đất, trầm tích. Sử dụng 100 - 200 ml các dung môi n-hexan, toluen để chiết PCB trong 10 - 100 g mẫu đất, trầm tích. Dung môi chiết đƣợc làm bay hơi, ngƣng tụ, lọc thấm qua mẫu, hoàn tan chất phân tích, chảy tràn xuống bình chứa mẫu tuần hoàn theo chu kỳ. Các chất phân tích trong mẫu sẽ đƣợc chiết sang pha hữu cơ. Thiết bị chiết soxhlet bao gồm: bếp gia nhiệt, bình cầu chứa dung môi và dịch chiết, ống chứa mẫu và sinh hàn. Mẫu đƣợc gói bằng giấy lọc và đặt vào trong ống chứa mẫu.
Dịch chiết đƣợc làm sạch sơ bộ bằng H2SO4, KOH, làm sạch và tách phân đoạn trên cột silicagel đƣợc kiềm hóa, axít hóa, cột than hoạt tính; cột ôxít nhôm; làm bay hơi dung môi đến thể tích định mức và định lƣợng bằng phƣơng pháp phân tích phù hợp.
Phương pháp tách chiết, làm giàu PCB trong mẫu nước
Hiện nay, trong phân tích dịch vụ, các phòng thí nghiệm thƣờng sử dụng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng (LLE) dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất tan vào hai pha không trộn lẫn, từ đó tách chất phân tích ra khỏi nền. Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng. Các dung môi đƣợc chọn cho quá trình chiết thƣờng là n-hexan, diclometan. Dịch chiết đƣợc làm sạch sơ bộ bằng H2SO4; KOH; NaCl; làm sạch trên cột silicagel, cột ôxít nhôm; làm bay hơi dung môi đến thể tích định mức, định lƣợng bằng phƣơng pháp phân tích phù hợp.
2.3.2. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp GC/MS
Trong sắc kí khí, mẫu đƣợc tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này. Khí mang đƣa mẫu từ buồng bay hơi vào cột tách, quá trình tách sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột
25 tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, máy tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả. Trên sắc đồ có các tín hiệu ứng với các cấu tử cần tách gọi là pic. Thời gian lƣu của pic là đại lƣợng định tính cho chất cần tách. Còn diện tích của pic là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu [10], [15]. Hình 2.1 là sơ đồ thiết bị sắc kí khí.
Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị sắc kí khí
Trong thiết bị sắc ký quan trọng nhất là hệ thống cột tách và detector. Cột tách sắc ký
Trên thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích nghiên cứu. Nói chung, cột tách sắc ký cần đạt các yêu cầu sau:
- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh, nhờ việc tối ƣu hóa các thông số của phƣơng trình Van Deemter.
- Độ thấm cao, tức là độ giảm áp nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định; - Khả năng tải trọng cao của cột (các cấu tử cần tách – pha tĩnh) phụ thuộc vào kiểu cột tách, hệ số phân bố của cấu tử trong đó pha tĩnh.
- Phải có khoảng nhiệt độ rộng, làm việc đƣợc ở nhiệt độ cao.
Detectơ khối phổ [10], [15]
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối lƣợng
26 và điện tích (m/z). Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm bớt điện tích của chúng (nhƣ lọai bỏ electron, proton hóa, đề proton hóa, ...). Các ion tạo thành này đƣợc tách theo tỷ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của các hợp chất. Nguyên tắc của các khối phổ là các phân tử đã đƣợc ion hóa sẽ phân mảnh thành các mảnh có cấu trúc khác nhau dựa trên tỷ số giữa khối lƣợng và điện tích của chúng trên cơ sở từ trƣờng hoặc điện trƣờng. Hình 1.7 biễu diễn sơ đồ liên hợp GC/MS.
Hình 2.2. Sơ đồ liên hợp GC/MS
Các thiết bị khối phổ bao gồm các thành phần sau:
- Nguồn để ion hóa mẫu thƣờng đƣợc gọi là buồng ion hóa;
- Bộ phận phân tách trong đó các ion đƣợc tạo ra sẽ đƣợc phân tách dựa trên tỷ số giữa khối lƣợng và điện tích của chúng;
- Bộ phân phát hiện có thể phát hiện các ion và đo khối lƣợng của chúng. Hình 2.3 mô tả quá trình tạo tín hiệu phân tích bằng phƣơng pháp GC/MS:
Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý tạo tín hiệu bằng phƣơng pháp GC/MS
Tỷ số mci/ zci Thời gian lƣu tci
27 Với việc sử dụng detector khối phổ cho phép thu đƣợc những thông tin rất quý giá trong việc xác định cấu trúc của các chất mới, đặc biệt là khi không có chất chuẩn. Chính nhờ hai thông thời gian lƣu (RT) và tỷ số m/z mà việc định tính, định lƣợng PCB bằng GC/MS có độ chính xác, độ tin cậy cao hơn.
2.3.3. Phân tích định tính và định lượng PCB trên GC/MS
Phân tích định tính
Trong sắc kí khí, thời gian lƣu là những đại lƣợng đặc trƣng định tính cho cấu tử cần phân tích. Phân tích định tính thƣờng dựa trên so sánh thời gian lƣu của cấu tử cần xác định với chất chuẩn hoặc dùng phƣơng pháp thêm. Một trong những ƣu việt của phƣơng pháp GC/MS là cho phép ta quan sát đƣợc cả thời gian lƣu và tỷ số khối lƣợng trên điện tích (m/z) của các ion cần quan tâm, đặc biệt là ion phân tử và ion đặc trƣng của các chất. Một pic ứng với chất phân tích khi thoả mãn các điều kiện sau:
- Thời gian lƣu phải trùng với thời gian lƣu của chất chuẩn (± 3s so với thời gian lƣu của chất chuẩn).
- Phổ MS của pic này phải chứa các ion đặc trƣng của chất quan tâm và tỷ lệ giữa các ion tính theo diện tích pic phải nằm trong giới hạn cho phép (tỷ lệ giữa các ion tính theo diện tích pic không lệch quá ±20% so với giá trị lý thuyết).
Phân tích định lượng
Cơ sở cần thiết để đánh giá định lƣợng là các cấu tử cần phải tách khỏi nhau hoàn toàn mà không có pic này chồng lên pic khác. Việc nhận biết các cấu tử quan trọng cần phải đƣợc xác định, trên cơ sở đó tra cứu những hệ số hiệu chỉnh tƣơng ứng từ các dữ liệu tham khảo.
Trƣớc khi thực hiện phân tích định lƣợng cần kiểm tra các điều kiện sau:
- Độ phân giải của cột mao quản đối với 12 WHO-PCB: phân tách hoàn toàn. - Độ lệch của hệ số đáp ứng tƣơng quan của các chất chuẩn trong đƣờng chuẩn ban đầu không lệch quá ±15%.
28 - Độ lệch của hệ số đáp ứng tƣơng quan các chất chuẩn trong dung dịch kiểm tra đƣờng chuẩn so với đƣờng chuẩn ban đầu không lệch quá ±30%.
Để định lƣợng 12 đồng loại WHO-PCB, chúng tôi tiến hành định lƣợng theo chất nội chuẩn 13C-PCB thêm vào mẫu ngay từ đầu quy trình thực nghiệm.
2.4. Tiến hành nghiên cứu
2.4.1. Tạo mẫu nghiên cứu
Mẫu nước: Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách đong 4,0 L nƣớc cất hai lần vào bình thủy tinh sạch, thêm 0,5 ml dung dịch chuẩn chứa 12 chất chuẩn WHO-PCB, mỗi chất có nồng độ từ 2 đến 20 ng/ml, lắc nhẹ trong vài phút đƣợc mẫu nghiên cứu.
Mẫu đất, trầm tích: Sẽ rất khó để chuẩn bị một mẫu giả có nền giống hoàn toàn với mẫu thật vì chất phân tích sau khi đƣợc thêm vào mẫu sẽ hấp phụ phía ngoài hạt đất, trầm tích. Thực tế trong đất, trầm tích thì chất phân tích có thể phân bố toàn bộ trong các hạt. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng silicagel, cát không có PCB làm mẫu thử nghiệm.
Dung dịch nghiên cứu qua các cột hấp phụ:Dùng pippet hút chính xác 0,5 ml dung dịch chuẩn chứa 12 chất chuẩn WHO-PCB, mỗi chất có nồng độ 2 - 20 ng/ml, hòa tan trong 30 ml n-hexan, lắc nhẹ trong 2 phút đƣợc dung dịch nghiên cứu.
Dung dịch đối chứng: Lấy dung dịch nghiên cứu ở phần trên, thêm vào 0,5 ml dung dịch chuẩn 13C12-PCB có nồng độ 20 ng/ml.
2.4.2. Phương pháp khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu
Tách chiết mẫu
Dựa trên tính chất hóa lý của chất phân tích và nền mẫu, dung môi tách chiết đƣợc lựa chọn dựa trên độ phân cực, khả năng tƣơng tác với chất phân tích, tỷ trọng, nhiệt độ sôi. Chúng tôi chọn 3 loại dung môi để khảo sát quy trình tách chiết mẫu là toluen, n-hexan, diclometan và tiến hành tách chiết mẫu bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng với mẫu nƣớc, chiết soxlet với mẫu đất, trầm tích.
29
Làm sạch, làm giàu dịch chiết trên cột hấp phụ
- Dùng H2SO4 96%, NaCl 5%, KOH 17% làm sạch sơ bộ dịch chiết mẫu. - Dùng cột “đa lớp”: Na2SO4 khan/ SiO2 tẩm KOH/ 3 lớp (Na2SO4 / SiO2 tẩm H2SO4) với dung môi rửa giải n-hexan.
- Dùng cột nhôm ôxít để tách phân đoạn 12 đồng loại WHO-PCB bằng hỗn hợp hexan:diclometan (95:5).
Tối ƣu hóa lƣợng chất hấp phụ, chúng tôi khảo sát ở các mức khối lƣợng nhôm ôxít lần lƣợt là 3 g, 4 g, 6 g, 8g.
Tối ƣu hóa thể tích dung môi rửa giải, sử dụng hỗn hợp hexan:diclometan (95:5) làm dung môi rửa giải và khảo sát ở các mức thể tích 15, 30, 50 ml.
2.4.3. Lựa chọn, tối ưu các điều kiện phân tích sắc ký
Việc phân tích định tính và đinh lƣợng 12 WHO-PCB đƣợc tiến hành trên Sắc kí khí khối phổ GC6890/ MSD5972A Hewlett Packard, USA.
Để tìm điều kiện phân tích tối ƣu trên thiết bị chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột sắc ký DB-5MS và cột BPX-DXN với các thông số chƣơng trình nhiệt độ, lƣu lƣợng khí mang,… đã đƣợc lựa chọn, tối ƣu.
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm
Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê, sử dụng các phần mềm Minitab 15.0 và Origin 6.0.
30
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Lựa chọn các điều kiện phân tích WHO-PCB trên GC/MS
Bơm 1 µl hỗn hợp dung dịch chuẩn WHO-PCB nồng độ 0,05 - 0,5 ng/µl và
13C12-PCB nồng độ 0,5 ng/µl vào máy sắc kí khí khối phổ và thu lấy sắc đồ. Các điều kiện trên máy đƣợc khảo sát và tối ƣu hóa nhằm đạt độ phân giải cao nhất có thể.
Cột DB-5MS (60m x 0,25mm x 0,25m):
Phƣơng pháp quét lựa chọn ion (SIM) để ghi tín hiệu các ion đặc trƣng của PCB. Thể tích bơm mẫu: 1 l. Khí mang He, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 280 oC. Chƣơng trình nhiệt độ cho cột: Nhiệt độ ban đầu 150oC (giữ 2 phút), tăng 20 độ/ phút đến 220 oC (giữ 16 phút), tăng 5 độ/ phút từ 220 oC đến 320
oC, giữ ở nhiệt độ 320 oC cho đến kết thúc. Nhiệt độ bộ phận ghép nối sắc kí khí- khối phổ: 290 oC.
Cột BPX-DXN (60m x 0,25mm x 0,25m):
Phƣơng pháp quét lựa chọn ion (SIM) để ghi tín hiệu các ion đặc trƣng của PCB. Thể tích bơm mẫu: 1 l. Khí mang He, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 280 oC. Chƣơng trình nhiệt độ cho cột: Nhiệt độ ban đầu 150oC (giữ 2 phút), tăng 20 độ/ phút đến 220 oC (giữ 16 phút), tăng 5 độ/ phút từ 220 oC đến 320
oC, giữ ở nhiệt độ 320 oC cho đến kết thúc. Nhiệt độ bộ phận ghép nối sắc kí khí- khối phổ: 290 oC.
31 Bảng 3.1. Thời gian lƣu, diện tích pic của 12 đồng loại
WHO-PCB khi khảo sát trên cột BPX-DXN và DB-5MS
Đồng loại WHO-PCB Cột BPX-DXN Cột DB-5MS tR (phút) Spic tR (phút) Spic 13C12-3,4,4',5-TeCB (81) 26,24 15486 24,19 11609 3,4,4',5-TeCB 26,26 1642 24,20 1142 13C12-3,3',4,4'-TeCB (77) 26,98 14851 24,97 11496 3,3',4,4'-TeCB 27,01 774 24,99 577 13C12-2',3,4,4',5-PeCB (123) 28,22 12217 26,44 9154 2',3,4,4',5-PeCB 28,24 1300 26,46 838 13C12-2,3',4,4',5-PeCB (118) 28,48 12854 26,71 9619 2,3',4,4',5-PeCB 28,50 13791 27,72 9133 13C12-2,3,4,4',5-PeCB (114) 29,18 12357 27,41 9335 2,3,4,4',5-PeCB 29,20 1267 27,43 858 13C12-2,3,3',4,4'-PeCB (105) 30,15 11984 28,41 9409 2,3,3',4,4'-PeCB 30,17 1262 28,42 8725 13C12-3,3',4,4',5-PeCB (126) 32,10 10311 30,47 9557 3,3',4,4',5-PeCB 32,12 1099 40,48 928 13C12-2,3',4,4',5,5'-HxCB (167) (167) (167) (167) 32,97 8226 31,49 6807 2,3',4,4',5,5'-HxCB 32,98 842 31,51 737 13C12-2,3,3',4,4',5-HxCB (156) 34,19 7964 32,72 6873 2,3,3',4,4',5-HxCB 34,20 3810 32,73 3455 13C12-2,3,3',4,4',5'-HxCB (157) 34,43 7390 32,96 6594 2,3,3',4,4',5'-HxCB 34,44 746 32,98 687 13C12-3,3',4,4',5,5'-HxCB (169) ()(169) 36,05 6810 34,64 7168 3,3',4,4',5,5'-HxCB 36,06 648 34,65 711 13C12-2,3,3',4,4',5,5'-HpCB (189) (189) 37,63 4229 36,33 4965 2,3,3',4,4',5,5'-HpCB 37,64 454 36,34 548
Từ bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy khả năng phân tách 12 đồng loại WHO- PCB giữa hai cột mao quản BPX-DXN và cột DB-5MS là nhƣ nhau. Tuy nhiên, cột BPX-DXN cho tín hiệu đáp ứng tốt hơn so cột DB-5MS, độ phân giải của cột đối với 12 đồng loại WHO-PCB là phân tách hoàn toàn. Do vậy chúng tôi chọn cột BPX-DXN để sử dụng trong nghiên cứu của luận văn với các thông số khảo sát đƣợc tối ƣu nhƣ sau:
32
Các thông số sắc kí khí:
Kiểu bơm mẫu: không chia dòng.
Thể tích bơm mẫu: 1 ± 0,2 l.
Khí mang He (99,999%).
Chế độ dòng không đổi: 1,0 ml/phút.
Nhiệt độ buồng bơm mẫu (injector): 280 oC.
Chƣơng trình nhiệt độ cho cột: Nhiệt độ ban đầu 150oC (giữ 2 phút), tăng 20 độ/ phút đến 220 oC (giữ 16 phút), tăng 5 độ/ phút từ 220 oC đến 320 oC, giữ ở nhiệt độ 320 oC cho đến kết thúc.
Các thông số khối phổ:
Nhiệt độ bộ phận ghép nối sắc kí khí-khối phổ (interface): 290 oC.
Phƣơng pháp quét lựa chọn ion (SIM) để ghi tín hiệu các ion đặc trƣng của PCB.
Kiểu ion hóa: EI
Thế detector: 70 eV
Sau khi lựa chọn tối ƣu các điều kiện phân tích sắc kí, mẫu nghiên cứu đƣợc bơm vào thiết bị theo các điều kiện trên. Các mảnh ion đặc trƣng đƣợc lựa chọn trên cơ sở tham khảo thƣ viện phổ cấu trúc. Phƣơng pháp quét lựa chọn ion ghi tín hiệu các ion đặc trƣng, có thể phát hiện đƣợc những ion này ngay khi ở nồng độ rất thấp và thu đƣợc phổ khối các ion chọn lọc này.
Nhƣ vậy, với thiết bị Sắc kí khí-khối phổ ta có thể thu đƣợc sắc đồ của riêng 12 đồng loại WHO-PCB mà không bị lẫn nhóm chất nào có thời gian lƣu gần hoặc nằm trong khoảng thời gian lƣu của 12 WHO-PCB. Bảng 3.2 đƣa ra thông số đặc trƣng trong định tính 12 đồng loại WHO-PCB.
33 Bảng 3.2. Ion đặc trƣng, tỷ lệ các ion đồng vị của các WHO-PCB [46]
Tên chất Ion đinh lƣợng Ion tham
khảo (M-2Cl) (m/z)1 (m/z)2 Tỷ lệ đồng vị 13C12-3,4,4',5-TeCB (81) 302 304 0,65 - 0,89 3,4,4',5-TeCB 290 292 0,65 - 0,89 220