Do nhâ ̣n thấy các đă ̣c trƣng vâ ̣t lý nhƣ nhiê ̣t đô ̣ nóng chảy , dạng tinh thể , màu sắc tính tan của GPH 1 giống của β – Sitosterol một hơ ̣p chất có mă ̣t trong thành phân của hầu hết nhiều loài thƣ̣c vâ ̣t ở phân đoa ̣n di ̣ch phân bố n-Hexan.
Tiếp tục kiểm tra các dƣ̃ kiê ̣n vâ ̣t lý khác nhƣ Rf trên sắc kí bản mỏng , đô ̣ quay cƣ̣c thấy và so sánh với thƣ viện phổ đối với phổ 1
H – NMR hoàn toàn trùng khớp (hình 3.4).
Hình 3.3. Phổ 1
68
Kiểm tra vớ i các da ̣ng thuốc thƣ̉ khác nhau thấy xuất hiê ̣n màu giống hoàn toàn β – Sitosterol ( mẫu sẵn có )
Kết luâ ̣n: GPH1 chính là β – Sitosterol có cấu tạo:
HO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 19 11 12 13 14 15 16 17 18 20 22 23 24 28 29 25 27 28 21 3.1.4.Hơ ̣p chất GPH2:
Do nhận thấy các đă ̣c trƣng vâ ̣t lý nhƣ nhiê ̣t đô ̣ nóng chảy , trạng thái lỏng , màu sắc, tính tan của GPH2 giống củ a axit Oleic một hơ ̣p chất có mă ̣t trong thành phần của hầu hết nhiều loài thƣ̣c vâ ̣t ở phân đoa ̣n di ̣ch phân bố n-Hexan.
Tiếp tục kiểm tra các dƣ̃ kiê ̣n vâ ̣t lý khác nhƣ Rf trên sắc kí bản mỏng , đô ̣ quay cƣ̣c thấy và so sánh với thƣ viê ̣n phổ đối với phổ 1
H – NMR hoàn toàn trùng khớp.( hình 3.4)
69
Hình 3.4: Phổ 1H –NMR của GPH2
Kiểm tra vớ i các da ̣ng thuốc thƣ̉ khác nhau thấy xuất hiê ̣n màu giống hoàn toàn axit oleic
Kết luâ ̣n: GPH2 chính là axit oleic có cấu tạo:
OH O
3.2. Đánh giá hoạt tính sinh ho ̣c dịch phân bố và dịch chiết của cây Glycosmis petelotii
Hiện nay, bệnh tim mạch bao gồm các rối loạn tim mạch và mạch não là một trong những căn bệnh nguy hiểm, gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Do chứng cao huyết áp thƣờng dẫn tới các rối loạn tim mạch và mạch não nên việc phát hiện các hoạt chất có tác dụng chống co thắt, gây hạ huyết áp là một trong các hƣớng điều trị các chứng rối loạn nêu trên. Các chất gây giãn mạch ngoài tác dụng điều trị trong co
70
thắt mạch vành, mạch não, cao huyết áp còn có tác dụng nâng cao tuần hoàn ngoại vi.
Sự co và giãn của cơ trơn thành mạch máu là một hiện tƣợng đặc trƣng và phức tạp, đƣợc điều khiển tinh vi nhờ một loạt các yếu tố nhƣ các protein gây co mạch, các kênh ion và các phân tử truyền tín hiệu. Do vậy, việc phát hiện các chất có tác dụng giãn mạch cũng sẽ bao gồm việc tìm hiểu đƣợc bản chất của cơ chế điều khiển việc co giãn cấp tế bào, hiểu đƣợc sự phản hồi của mạch tới các tác nhân gây co mạch, gây giãn mạch và có tác dụng điều trị.
71
Tế bào nội mô (endothelial cell) là loại tế bào chính của lớp trong mạch máu. Là nơi tiếp xúc giữa mô và các thành phần có trong máu, lớp nội mô tham gia các quá trình điều hòa cục bộ của dòng máu và kích thƣớc mạch và chúng có nhiều chức năng quan trọng trong sức khỏe và bệnh tật. Các tế bào nội mô tổng hợp chất nội sinh là NO và H2O2 (chất giãn mạch phụ thuộc nội mô) có chức năng gây giãn mạch trong điều kiện sinh lý của cơ thể. Do vậy, để kiểm tra vai trò của lớp nội mô đối với chất có tác dụng giãn mạch, chúng tôi bố trí thí nghiệm để thử cả với vòng động mạch chứa và không chứa lớp nội mô.
3.2.1. Ảnh hƣởng của các chất khảo sát tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch K60
Vòng động mạch chuột bị loại bỏ lớp nội bào đƣợc ngâm tạo co thắt trong dung dịch PSS chứa 60 mM KCl (K60) cho tới khi bão hòa. Nồng độ chất thử tƣơng ứng liền đƣợc thêm vào vòng để tìm hiểu ảnh hƣởng của chất lên sự giãn cơ. Một đƣờng cong thể hiện nồng độ - phần trăm đáp ứng giãn cơ đƣợc theo đó dựng lên, trong đó phần trăm co thắt gây ra bởi K60 đƣợc coi là 100%. Các số liệu đƣợc trình bày là giá trị trung bình của các thí nghiệm lặp lại (mean ± e.s. (n = 4-7)).
Hình 3.5.a: Đường biểu diễn sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ chất thử trên vòng động mạch chuột loại lớp tế bào nội mô, được gây co tới bão hòa trước bằng dung dịch PSS chứa 60mM KCl (K60) (n 3- 7).
Ở hình 3.5.a Emax là giá trị hiệu quả giãn mạch, thể hiện bằng phần trăm co mạch còn lại của vòng động mạch bị gây co bởi K60 (100%) sau khi tiếp xúc với chất thử tại nồng độ thử cực đại chất thử tại nồng độ thử cực đại. Giá trị Emax càng
Effect of VIP on K60-induced contraction in rat aorta rings
0.1 1 10 100 0 50 100 VIP0007 VIP0008 VIP0017 VIP0001 VIP0004 VIP0018 VIP0019 VIP0020 VIP0024 VIP0027 VIP0026 VIP0002 VIP0025 VIP0021 VIP0028 VIP0015 VIP0022 VIP0029 VIP009 [drug]g/ml R is p o st a ( % )
72
nhỏ chứng tỏ phần trăm giãn mạch càng lớn, chất thử càng có tiềm năng phát triển làm thuốc giãn mạch. Những hoạt chất và dịch chiết có giá trị Emax ≤50% đƣợc tiếp tục thử để đo nồng độ gây ức chế 50%. Trong đó có VIP 11 có Emax (%) là 8.3 ± 3.5, vớ i IC50 (µg/ml) là 15.62 ± 3.28.
Hình 3.5.b thể hiện sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ của các chất thử có Emax
50% trên vòng động mạch chuột loại lớp tế bào nội mô, đƣợc gây co tới bão hòa trƣớc bằng dung dịch PSS chứa 60mM KCl (K60) (n =4-7). Tất cả các hoạt chất và dịch chiết thử nghiệm có giá trị IC50 trong khoảng 13 và 63 μg/ml.
0.1 1 10 100 0 50 100 05 [VIP] (g/ml) 10 14 13 11 12 23 16 03 06 R is p o st a ( % d i K 6 0 )
Hình 3.5.b.Đường biểu diễn sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ của các chất thử có
Emax 50% trên vòng động mạch chuột loại lớp tế bào nội mô, được gây co tới
bão hòa trước bằng dung dịch PSS chứa 60mM KCl (K60) (n =4-7).
VIP11 chính là dịch chiết của cây Cơm rƣợu petelotii (Glycosmis petelotii
Guillt). Dịch chiết có hoạt tính giãn cơ khá cao, thể hiện ở giá trị Emax phần trăm co cơ còn lại là 11.7 ± 3.9 (%) và IC50 15.62 ± 3.28 (µg/ml).
3.2.2. Ảnh hƣởng của các chất khảo sát tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch phenylephrine
VIP11 là một trong những dịch chiết có tác dụng giãn mạch cao nhất trên động mạch chủ cô lập đã loại bỏ lớp nội bào, đƣợc gây co nhờ phenylephrine 0,3 μM. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở Hình 3.5.c và Bảng 3.3
73 0.1 1 10 100 0 50 100 [VIP] (g/ml) 10 11 14 06 R is p o st a ( % d i fe n il ef ri n a )
Hình 3.5.c.Đường biểu diễn sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ của các chất thử trên
vòng động mạch chuột loại lớp tế bào nội mô (-EC), được gây co tới bão hòa trước bằng phenylephrine 0,3 μM. (n =3-6). Các giá trị được trình bày bằng mean ± e.s.
(n = 3-6). Tại trục tung, co cơ gây ra bởi phenylephrine được coi là 100%. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dịch chiết VIP 11 lên khả năng giãn cơ bị loại bỏ nội bào
(-EC) và còn lớp nội bào (+EC)gây co bão hòa bằng phenylephrine
VIP -EC +EC
IC50 (µg/ml) Emax IC50 (µg/ml) Emax
11 38.12 ± 7.43* 7.0 ± 3.1 60.10 ± 3.09** 17.3 ± 7.9
Dịch chiết VIP 11 có giá trị hiệu quả giãn mạch cao, thể hiện ở giá trị Emax là 7.0 ± 3.1 (%) và IC50 38.12 ± 7.43(µg/ml).
3.2.3. Ảnh hƣởng của các dịch chiết khảo sát tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột, còn lớp tế bào nội mô (+EC) và gây co nhờ dung dịch phenylephrine
VIP11 là một trong những dịch chiết có tác dụng giãn mạch cao nhất trên động mạch chủ cô lập vẫn còn lớp tế bào nội mô, đƣợc gây co nhờ phenylephrine 0,3 μM. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Hình 3.5.dvà Bảng 3.3.
74 0.1 1 10 100 0 50 100 [VIP] (g/ml) 10 06 11 14 R is p o st a ( % d i fe n il e fr in a )
Hình 3.5.d.Đường biểu diễn sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ của các chất thử trên
vòng động mạch chuột còn lớp tế bào nội mô (+EC), được gây co tới bão hòa trước bằng phenylephrine 0,3 μM. (n =3-5). Các giá trị được trình bày bằng mean ± e.s.
(n = 3-6). Tại trục tung, co cơ gây ra bởi phenylephrine được coi là 100%.
VIP11 là một trong những dịch chiết có tác dụng giãn mạch cao nhất trên động mạch chủ cô lập vẫn còn giữ lớp nội bào, đƣợc gây co nhờ phenylephrine 0,3 μM. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở Hình 3.5.d và Bảng 2 trình bày giá trị Emax và IC50.
Kết quả cho thấy dịch chiết VIP11 gây giãn mạch không phụ thuộc lớp tế bào nội mô endothelium cells.
3.2.4. Ảnh hƣởng của phân đoạn từ dịch chiết tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột, đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch K60
Dịch chiết VI P11 là một trong những dịch chiết có tác dụng giãn cơ mạnh và hiệu quả nhất trong số các dịch chiết khảo sát. Hai dịch chiết methanol tổng này liền đƣợc tiếp tục chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau, có độ phân cực tăng dần là n-Hexane, chloroform, ethylacetate, buthanol và nƣớc. Sau khi cô đặc, đuổi dung môi dƣới áp suất giảm, chúng tôi đã thu đƣợc các cao khô của các phân đoạn chiết tƣơng ứng VIP11H, VIP11C, VIP11E, VIP11B và VIP11W. Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính giãn mạch của các cao khô này trên vòng động mạch chuột đã đƣợc làm co bằng dung dịch 60mM KCl, không có mặt các tế bào nội mô (-EC) và xác định đƣờng giãn mạch phụ thuộc nồng độ ccuar các dịch chiết tƣơng ứng. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.5.e
75 1 10 100 0 50 100 [VIP] (g/ml) 11 11B 11C 11E 11H 11W 14 14B 14C 14E 14W R is p o st a ( % d i K 6 0 )
Hình 3.5.e. Đường biểu diễn sự giãn mạch phụ thuộc nồng độ của phân đoạn dịch phân bố trên vòng động mạch chuột loại lớp tế bào nội mô (-EC), được gây co tới bão hòa trước bằng K60. Các giá trị được trình bày bằng mean ± e.s. (n =1-2). Tại
trục tung, co cơ gây ra bởi K60 được coi là 100%.
Kết quả cho thấy phân đoạn chloroform của dịch chiết VIP11 có khả năng giãn mạch hiệu quả nhất. Hơn nữa, khả năng của dịch chiết phân đoạn chloroform VIP11C cao hơn cả dịch chiết tổng methanol VIP11.
Kết quả nghiên cứu sàng lọc bƣớc đầu cho thấy dịch chiết VIP11 từ cây
Glycosmis petelotii gây giãn mạch trên động mạch chuột đã bị gây co bởi K60 hoặc
phenylephrine không phụ thuộc nội bào.
Các chất giãn mạch không phụ thuộc nội bào (endothelium-independent vasodilators) ví dụ nhƣ nicardipine, nifedipine, diltiazem và verapamil … là những thuốc chẹn kênh Canxi, gây giãn mạch đã đƣợc lƣu hành rộng rãi trên thị trƣờng, gây ra hiệu ứng giãn mạch theo cơ chế tác dụng lên các kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế (voltage-dependent Ca2+ channels (VDC)) và kênh Ca2+ điều khiển thụ thể (Receptor-operated Ca2+ channels (ROC))làm giảm nồng độ ion Ca2+ trong cơ trơn, do đó dẫn tới giãn mạch cơ.
3.3. Thử hoạt tính chống ung thƣ
Hoạt tính chống ung thƣ của các dịch chiết đƣợc sàng lọc trên dòng ung thƣ vú (MCF-7) và ung thƣ gan (SK-Hep-1) ở ngƣời
76
3.3.1.Kết quả sàng lọc trên dòng ung thƣ gan ngƣời SK-Hep-1 và ung thƣ vú MCF-7
Trên hai phép thử khá phổ biến sàng lọc hoạt chất chống ung thƣ trên hai dòng tế bào ung thƣ là dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 (human breast adenocarcinoma) và ung thƣ gan ác tính SK-Hep-1 (human liver adenocarcinoma). Kết quả sàng lọc đƣơ ̣c trình bày trên bảng sau:
Bảng 3.4: Kết quả sàng lọc chống ung thư gan và ung thư phổi qua phép thử MCF- 7 và SK-Hep-1 của Glypetelotine, kết quả đợt 1/2011.
(CI -concentration inhibitory %)
Name Origin SK-Hep-1
cytotoxicity (CI%)
MCF-7 cytotoxicity ug/ml
CI% ug/ml CI%
glypetelotin Glycosmis petelotii 0.1 7.606 0.1 -1.71 1 9.975 1 -0.18 10 12.54 10 8.166
Kết quả cho thấy có khả năng ức chế 8-12% cả hai loại ung thƣ phổi và ung thƣ vú.
3.3.2.Sàng lọc trên phép thử Wnt
Phƣơng pháp thử hiện đại nhất trong sàng lọc hoạt chất chống ung thƣ, dựa trên các tín hiệu protein Wnt. Kết quả cho thấy:
Bảng 3.5: Kết quả sàng lọc hoạt tính trên Wnt
Stt Code Wnt signaling
21 VHKC-0021 0.35
77
3.4. Kết luâ ̣n:
Từ cành và lá cây cơm rƣơ ̣u (Glycosmis petelotii) đã phân lâ ̣p đƣợc hai alkaloid demethyglypetelotine và glypetelotine , trong đó demethylpetelotine là mô ̣t hơ ̣p chất mới, lần đầu đƣợc phân lâ ̣p. Ngoài ra đã phân lập và xác định cấu trúc của các chất β – Sitosterol, Axit oleic.
Đã đánh giá hoa ̣t tính của các chất khảo sát , trong đó có di ̣ch chiết MeOH của
Glycosmis petelotii và các dịch phân bố, tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột
đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch K60; tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch phenylephrine; tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột, còn lớp tế bào nội mô (+EC) và gây co nhờ dung dịch phenylephrine và tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột, đã loại bỏ lớp tế bào nội mô (-EC) và gây co nhờ dung dịch K60.
Kết quả khảo sát bƣớc đầu cho thấy di ̣ch chiết MeOH và các di ̣ch phân bố của
cây Glycosmis petelotii có hoạt tính tốt với các thử nghiệm trên , đă ̣c biê ̣t là di ̣ch
phân bố trong Clorofom.
Đánh giá hoạt tính gây đô ̣c tế bào ung thƣ của các dịch chiết đƣợc sàng lọc trên dòng ung thƣ vú (MCF-7) và ung thƣ gan (SK-Hep-1) ở ngƣời. Thử sàng lọc trên Wnt/b-catenin signalling pathway.
78
Bảng 3.6: Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ cây cơm rượu Glycosmis petelotii trong khuôn khổ luận văn:
MC -340
Demethylglypetelotine (lần đầu tiên đƣơ ̣c phân lâp)
NH CH2 CH2 N S CH3 CH3 O H H H H H 4 5 6 7 8 9 1 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 2 MC – 339 ( MC – 308) Glypetelotine HO 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 19 11 12 13 14 15 16 17 18 20 22 23 24 28 29 25 27 28 21 GPH1 -Sitosterol OH O GPH2 Axit oleic
79
KẾT LUẬN:
Nhƣ vâ ̣y sau thời gian thƣ̣c hiê ̣n luâ ̣n văn với đề tài : " Đóng góp mới về nghiên cƣ́u thành phần hóa ho ̣c loài cơm rƣơ ̣u (Glycosmis petelotii) ở Việt Nam'' tôi đã hoàn thành nhƣ̃ng mu ̣c tiêu sau:
1. Tổng quan các tài liê ̣u tron g nƣớc và ngoài nƣớc có liê n quan đến cây Glycosmis
petelotii, thành phần hóa học của chi, hoạt tính sinh học của các h ợp chất phân lâ ̣p
tƣ̀ chi Glycosmis, giớ i thiê ̣u về cây Glycosmis petelotii.
2. Đã xây dƣ̣ng đƣơ ̣c quy trình chiết xuất và phân lâ ̣p các chất tƣ̀ căn chiết cây
Glycosmis petelotii.
3. Đã phân lâ ̣p và xác đi ̣nh cấu trúc hóa ho ̣c đƣơ ̣c 4 hơ ̣p chất: demethyglypetelotine, glypetelotine, axit oleic, β-sitosterol, trong đó alkaloid demethyglypetelotine là dẫn xuất lần đầu tiên đƣơ ̣c phân lâ ̣p tƣ̀ thƣ̣c vâ ̣t.
4. Đã đánh giá tác dụng gây giãn mạch động mạch chuột của các dịch chiết có dịch chiết MeOH và di ̣ch phân bố của mô ̣t số loài ho ̣ Rutaceae . Trong đó di ̣ch phân bố trong Clorofom của lá cây Glycosmis petelotii có tác dụng mạnh.
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của chất glypetelotine đƣợc sàng lọc trên dòng ung thƣ vú (MCF-7) và ung thƣ gan (SK-Hep-1) ở ngƣời. Thử sàng lọc trên Wnt/b-catenin signalling pathway.
80
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học, Hà Nội, tr.142-143.
2. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Tập 1, tr. 542.
3. Mai Hù ng Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính