Mẫu Cây cơm rƣợu đƣợc thu hái tại rừng Cúc Phƣơng, thuộc tỉnh Ninh Bình, Việt Nam vào tháng 5 năm 2011. Tên cây đƣợc xác định bởi nhà thực vật học Ngô Văn Trại- Viện Dƣợc liệu. Mẫu tiêu bản số C-451 đƣợc lƣu tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu lấy về đƣợc rửa sạch, loại bỏ lá hƣ hỏng, phơi đến khô trong râm, sấy ở nhiệt độ 400C đến giòn, nghiền nhỏ thành dạng bột, bảo quản nơi khô ráo.
Cành và lá cây phơi khô , nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết vớ i metanol ở nhiệt độ phòng. Và chiết lần lƣợt bằng các dung môi n – hexan, chloroform, etyl axetat và butanol cho các cặn chiết tƣơng ứng.
Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký là dung môi công nghiệp đƣợc làm khan, lọc và cất lại trƣớc khi sử dụng.
2.1.1.Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Các phƣơng pháp sắc ký đƣợc sử dụng để nhận biết và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thƣờng (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)). Bên cạnh đó còn dùng phƣơng pháp kết tinh để thu chất sạch.
2.1.2.Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra đƣợc xác định bằng cách kết hợp các phƣơng pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phƣơng pháp phổ nhƣ: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D, 2D-NMR).
2.1.3.1. Xác định điểm chảy:
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Boetius.
2.1.2.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)
Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS đƣợc ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đƣợc đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS.
32
2.1.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều đƣợc ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
2.1.3.Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học: 2.1.3.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính tim ma ̣ch: 2.1.3.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính tim ma ̣ch:
Contraction là p hép thử đƣợc dùng trong sàng lọc các hoạt chất điều trị tim mạch, đƣợc đánh giá khá đắt tiền và hiện đại. Phép thử trên kênh Ca2+
và phép thử chống co thắt. Phƣơng pháp cho kết quả giá trị % độ giảm (% decrease), dùng để đánh giá khả năng điều trị bệnh tim.
2.1.3.2. Phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thƣ:
Các phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thƣ thực hiện trong đề tài này bao gồm: phép thử xác định độc tính với các dòng tế bào ung thƣ và phép thử trên cơ sở đích phân tử (Wnt/b-catenin signalling pathway).
2.2. Phần thƣ̣c nghiê ̣m:
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Cành và lá cây (10,4 kg/3) G. petelotii đã phơi khô, nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết với 35 lít metanol ở nhiệt độ phòng, lọc và cô cất trong chân không. Phần cặn metanol (1,27 kg) đƣợc hoà trong lƣợng tƣơng đƣơng MeOH - H2O (tỉ lệ 1 : 1) và chiết lần lƣợt bằng các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần n–hexan, cloroform, ethylaxetat và butanol. Sau khi cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cặn chiết tƣơng ƣ́ng và dịch nƣớc còn lại.
33
Sơ đồ 2.1: Quá trình tách chiết C451 – Glycomis petelotii
2.2.1.1. Quá trình phân lập cặn chiết n-hexan:
Cặn dịch chiết n-hexan đƣợc hoà tan bằng một lƣợng n-hexan vừa đủ. Dung dịch thu đƣợc đem trộn với một lƣợng vừa đủ silica gel Merck, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này đƣợc đƣa lên cột sắc ký. Cột sắc ký đƣợc nhồi silica gel Merck (loại 400 – 630 mesh) theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt với dung môi n-hexan. Cột sau khi đã tƣơng đối ổn định, bột silica gel tẩm dịch chiết đƣợc đƣa lên đầu cột, với hệ dung môi rửa giải là n -hexan; n-hexan/ Axeton : 40/1; 20/1; 10/1; 5/1; 100% Axeton. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng , vê ̣t chất đƣơ ̣c phát hiê ̣n dƣới đèn tƣ̉ ngoa ̣i ở hai bƣớc sóng 245nm,
10,4 kg mẫu khô ngâm trong 35 lít MeOH
2 lít dịch chứa 1,27 kg cao cô
Cất chân không
+1,8 lít H2O
+ V lít dung môi theo đô ̣ phân cƣ̣c tăng dần. + Cất quay chân không, quay bớ t dung môi
(chiết phân bố)
98,7g cao cô tƣ̀ dịch phân bố
Clorofom
90,1g cao cô tƣ̀ di ̣ch phân bố Etylaxetat 0,6l lít di ̣ch Butanol Dịch nƣớc + Metanol 231,242g cao cô tƣ̀ di ̣ch phân bố n - Hexan
34
365nm, vớ i thuốc hiê ̣n màu H2SO4 10%, gom các ph ần giốn nhau, cô quay để loa ̣i dung môi, thu đƣợc 7 phân đoa ̣n kí hiê ̣u 1 – 7.
Phân đoạn 2 tiếp tu ̣c tách bằng sắc kí cô ̣t với chất hấp phu ̣ silicagel , hê ̣ dung môi rƣ̉a giải: n-hexan : etylaxxetat ( 20 /1). Dịch thu đƣợc kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng , kết quả thu đƣợc 5 phân đoa ̣n 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5.
Phân đoa ̣n 2-3 tách phân lớp, lấy lớp dƣới, rƣ̉a bằng Metanol thu đƣợc hợp chất kí hiê ̣u là GPH2, phân đo ̣n 2-2 chạy tách trên cột YMC với hệ dung môi rủa giải M/ W ( 10/1 ) thu đƣợc hai phân đoa ̣n, trong đó 1 phân đoa ̣n kết tinh, rƣ̉a bằng MeOH thu đƣơ ̣c 1 chất sa ̣ch là: GPH1.
Sơ đồ 2.2: quá trình phân lập các chất từ cận chiết n – Hexan của cây Glycosmis petelotii
Că ̣n n-Hexan 100 g 100g
Phân đoa ̣n 2 Phân đoa ̣n 3-7; 1
SKC silicagel Hê ̣ dung môi : nHx/Ax:401/1 -
0/1
SKC silicagel
Hê ̣ dung môi: nHx/Et:20/1
Phân đoa ̣n 2-2
Phân đoa ̣n 2-1 Phân đoa ̣n 2-3
Phân đoa ̣n 2-4 Phân đoa ̣n 2-5
GPH1
GPH2
SKC YMC Hê ̣ dung môi M/W = 10/1 M/W = 10/1
35
2.2.1.2. Quá trình phân lập cặn chiết Cloroform
Cặn dịch chiết chloroform đƣợc hoà tan bằng một lƣợng Axeton vừa đủ. Dung dịch thu đƣợc đem trộn với một lƣợng vừa đủ silica gel Merck, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này đƣợc đƣa lên cột sắc ký. Cột sắc ký đƣợc nhồi silica gel Merck (loại 400 – 630 mesh) theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt với dung môi clorofom. Cột sau khi đã tƣơng đối ổn định, bột silica gel tẩm dịch chiết đƣợc đƣa lên đầu cột, với hệ dung môi rửa giải là Clorofom; Clorofom/ EtOAc : 19/1 – 1/1; Clorofom/ EtOAc / MeOH: 1/1/0,1; Clorofom/MeOH: 6/1 – 1/2 ; MeOH 100%; MeOH/ dd axit Clohiđric 2%: 9/1) tăng dần độ phân cực (gradient dung môi). Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng và gom những phân đoạn có sắc phổ giống nhau, kết quả thu đƣợc 13 phân đoạn khác nhau (ký hiệu G1÷ G13). Phân đoạn G1 sau đó đƣợc tiếp tục tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel (230-400mesh), triển khai theo chế độ gradient dung môi với dung môi rửa giải là n-Hex/Ax 1/0 – 0/1; MeOH; axit Tactric 3%. Quá trình rửa giải chúng tôi thu đƣợc 12 phân đoạn: GT1 – GT12
Hình 2.1: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cặn chiết sau quá trình chạy sắc kí cột
gradient dung môi, trướ c khi gom để thu được 12 phân đoạn, trên sắc kí lớp mỏng
36
Hình 2.2: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn từ GT1 – GT7 sau cột gradient trước khi
gom, chú ý cácphân đoan có 2 vạch chất màu vàng, không có vạch xanh phía trên
được dồn là phân đoạn GT5 ( hê ̣ dung môi tăn lên n-Hx/Ax 5/1, thử với thuốc thử H2SO4)
Phân đoạn GT5 sau đó đƣợc tiếp tục tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel (230-400 mesh), với hệ dung môi rửa giải là: n-Hex/Ax: 10/1 thu đƣợc 10 phân đoạn M1 – M10.
Phân đoạn M2 để bay hơi chậm với nhiệt độ phòng. Hòa tan chất dầu trong hỗn hợp dung môi n-hexan, kết tủa tinh thể dạng vảy trắng ngà rửa 3 lần bằng n-hexane (1ml). Thu đƣợc hợp chất sạch ký hiệu là MC – 308 .
Phân đoạn M4 để bay hơi chậm với nhiệt độ phòng. Hòa tan chất dầu trong hỗn hợp dung môi n-hexan, kết tủa tinh thể dạng kim dài trắng xanh rửa 3 lần bằng n-hexane (1ml). Thu đƣợc hợp chất sạch ký hiệu là MC - 340.
Phân đoạn M3 tinh chế bằng sắc kí cột trên chất hấp phụ silicagen ( 230 – 240 mesh) lấy phân đoạn dịch trong suốt, không màu, kết tinh chậm ở nhiệt độ phòng thu đƣợc tinh thể màu trắng, kí hiệu MC 339.
37
Sơ đồ 2.3: Sơ đồ qui trình phân lập các chất từ dịch chiết Clorofom của C-451
2.2.1.3. Quá trình phân lập cặn chiết Ethylaxetat:
Cặn dịch chiết Ethylaxetat m = 30 g đƣợc hoà tan bằng một lƣợng Metanol vừa đủ. Dung dịch thu đƣợc đem trộn với một lƣợng vừa đủ silicagel Merck, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này đƣợc đƣa lên cột sắc ký. Cột sắc ký đƣợc nhồi silica gel Merck (loại 400 – 630 mesh) theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt với dung môi clorofom. Cột sau khi đã tƣơng đối ổn định, bột silica gel tẩm dịch chiết đƣợc đƣa lên đầu cột, với hệ dung môi rửa giải là Clorofom; Clorofom/ EtOAc : 19/1 – 1/1; Clorofom/ EtOAc / MeOH: 1/1/0,1;
Că ̣n Cloroform
Phân đoa ̣n G1 Phân đoa ̣n G1→G13
SKC silicagel Hê ̣ dung môi: Cloroform/EtOA: 1/0 - 0/1
Cloroform/ MeOH : 1/0 – 0/1
SKC silicagel Hê ̣ dung môi: nHx/Ax: 1/0 – 0/1
Phân đoa ̣n GT5
Phân đoa ̣n GT 1→GT12
M1, M5 – M10 M2 M3 M4
Dịch màu vàng MC - 308 Dịch màu đen MC - 340MC
MC - 339
SKC silicagel Hê ̣ dung môi: nHx/Ax:10/1
Kết tinh châ ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng, rƣ̉a bằng n-
Hex
SKC silicagel
Hê ̣ dung môi: nHx/Ax: 5/1 Kết tinh châ ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng, rƣ̉a
38
Clorofom/MeOH: 40/1 – 5/1 ; MeOH 100%; tăng dần độ phân cực (gradient dung môi). Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng và gom những phân đoạn có sắc phổ giống nhau, kết quả thu đƣợc 6 phân đoạn khác nhau (ký hiệu E1÷ E6). Phân đoạn E5 ( m = 6 g) sau đó đƣợc tiếp tục tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel (230-400 mesh), triển khai theo chế độ gradient dung môi với dung môi rửa giải là C/M 1/0 – 0/1; Quá trình rửa giải thu đƣợc 5 phân đoạn: (E5 - N1) ÷ (E5 - N5)
+ Phân đoạn E5 – N2 ( m = 4g) sau đó đƣợc tiếp tục tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silicagel (230-400mesh), với hệ dung môi rửa giải là: 100% C; C/M/A: 20/1 /1; 20/1/3; 20/1,5/3; 20/3/6; 20/8/6; 2/1/1; 100% axeton; 100% MeOH thu đƣợc 12 phân đoạn *1 – *12. Kiểm tra sắc kí lớp mỏng, dự định tiếp tục tinh chế ở *8, *9 bằng hệ C/M/A:
Sơ đồ 2.4: quá trình phân lập cặn chiết Etylaxetat
Că ̣n etylaxetat
Phân đoa ̣n E5 Phân đoa ̣n E1→E6
SKC silicagel Hê ̣ dung môi: Cloroform/MeOH:
1/0 - 0/1
SKC silicagel Hê ̣ dung môi; Cloroform/MeOH
1/0 – 0/1
Phân đoa ̣n E5-N2
39
2.2.2. Thử hoạt tính sinh học. 2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu: 2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu:
Mẫu thực vật đã thu đƣợc xử lý và chiết với các dung môi methanol. Thu thập và tạo dịch chiết methanol của mẫu thực vật C – 451 Glycosmis petelotii; 5 mẫu phân bố trong các dung môi khác nhau của mẫu thực vật trên.
Theo danh mục dịch chiết các mẫu thực vật nó là mẫu C -451 với VIP-Code là VIP-0011, các dịch chiết phân bố trong các dung môi khác nhau của C – 451 liệt kê tại bảng sau:
Bảng 2.1. Các dịch chiết phân bố trong các dung môi khác nhau của C – 451
ST
T Đối tƣợng Ký hiệu mẫu lƣu
VIP-Code
1
Dịch chiết methanol
G.petelotii C-451 VIP-0011
2 Phân đoạn n-Hexane C-451H VIP-0011-H
3 Phân đoạn Clorofom C-451C VIP-0011-C
4 Phân đoạn Etylaxetat C-451E VIP-0011- E
5 Phân đoạn Butanol C-451B VIP-0011- B
6 Phân đoạn Metanol –
nƣớc C-451W VIP-0011- W
2.2.2.2. Thử hoạt tính tim mạch: a. Hóa chất
Dung dịch muối sinh lý chuẩn PSS chứa (mM): NaCl 125, KCl 5, CaCl2 2.7, MgSO4 1, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, và glucose 11 có pH 7.35. Dung dịch PSS chứa HEPES chứa mM: NaCl 130, KCl 5.6, HEPES 10, glucose 20, MgCl2.6H2O 1.2, và Napyruvate 5; pH 7.4. Dịch muối sinh lý Krebs–Henseleit PSS chứa (mM): NaCl 124, KCl 4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.1, KH2PO4 0.4, NaHCO3 25 và glucose 5.5. Duy trì tại 37oC thổi khí thành phần 95% O2 và 5% CO2. PSS chứa 60mM KCl đƣợc điều chế bằng cách thay thành phần NaCl bằng lƣợng tƣơng đƣơng KCl.
40
b. Động vật thí nghiệm
Tất cả động vất thí nghiệm đƣợc chăm sóc và thực nghiệm theo Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85–23, revised 1996) và phù hợp với Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của trƣờng Đại học Siena, Italy.
Chuột đực Sprague-Dawley (300-400g, nguồn Charles River Italia, Calco,
Italy) bị gây mê (qua ven i.p.) bằng hỗn hợp Ketavet (30 mg/kg ketamine; Intervet,
Aprilia, Italy) và Xilor1 (8 mg/kg xylazine; Bio 98, San Lazzaro, Italy), bị cắt đầu và rút hết máu.
Có 2 cách lấy động mạch chuột thí nghiệm.
- Lấy động mạch đuôi chuột: Đuôi chuột bị cắt khỏi thân, loại bỏ da và bảo dƣỡng trong dung dịch muối sinh lý (chứa mM: 125 NaCl, 5 KCl, 2.7 CaCl2, 1 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, and 11 glucose; pH 7.35) hoặc trong dung dịch ngoài (chứa, mM: 130 NaCl, 5.6 KCl, 10 HEPES, 20 glucose, 1.2 MgCl2_6 H2O, and 5 Napyruvate; pH 7.4). Động mạch chủ đuôi chuột đƣợc gỡ ra không bị dính các mô liên kết.
- Lấy động mạch cổ-bụng: Sau khi rút hết máu, mở lồng ngực, cắt bỏ phổi và tim để làm lộ động mạch. Đây là giai đoạn quan trọng vì có các thụ cảm dọc theo thành động mạch. Chọn lấy 2cm mô mạch đoạn nối giữa ngực-bụng không bị bám mao mạch và bị bao quanh bởi các mô liên kết. Trong quá trình thao tác đoa ̣n ma ̣ch không bi ̣ kéo căng để tránh động chạm tới lớp nội bào.
Rửa hết máu trong đoạn mạch, lắc trong bình. Giữ một đầu mạch bằng kềm forceps trong nƣớc muối để bảo tồn lớp nội bào. Sau đó đoạn động mạch đƣợc đặt trong đĩa Petri (đáy bằng silicon đen), cố định cả hai đầu bằng kim gài và loại bỏ các mô liên kết bằng nhíp và kéo.
- Tiếp theo, cắt mạch thành các vòng nhỏ có độ dài 1.5-3-4mm. Vòng càng dày thì độ co càng tốt. Cho phép thử độ co gây ra bởi Phe 0.3μM thì cho phép lớp nội bào
41
vòng khoảng 4mm. Sử dụng thiết bị vi phẫu và các giấy lọc đặt trong dung dịch muối để đặt các vòng động mạch.
Đoạn mạch đƣợc bảo trì trong dung dịch sinh hóa Krebs-Henseleit (KHS: với các thành phần (mm) 118.0 NaCl, 4.7 KCl, 25.0 NaHCO3, 1.8 CaCl2, 1.2 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 11.0 Glucose), tại nhiệt độ 37oC và oxy hóa bằng carbogen 95% O2, 5% CO2.
c. Thí nghiệm gây co thắt
Thí nghiệm đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của Saponara &cs. 2012. Các dịch chiết đƣợc thí nghiệm trên các vòng động mạch đuôi chuột. Vòng mạch để cân bằng ngoài 60 phút dƣới sức nặng của một vòng dây tungsten 40μm 1.5g cho vào bên trong mặt kính lumen, dùng thủy tinh Plexi nối với một máy cảm biến (2B Biological Instruments, Varese, Italy) nối với một thiết bị ghi bằng bút (Ugo Basile, Comerio, Varese, Italy). Toàn bộ thí nghiệm đƣợc ngâm trong một bể 2 buồng thể tích 20ml, chứa dung dịch muối sinh lý ở nhiệt độ 37o
C và sục liên tục khí hỗn hợp O2/CO2 95/5(%).
Thí nghiệm với vòng động mạch loại bỏ lớp nội bào (-ER): Lớp nội bào đƣợc loại đi bằng cách luồn một sợ dây thép không gỉ vào bên trong vòng và lăn nhẹ bề mặt bên trong của thành mạch. Sau thời gian cân bằng 60phút, 1mM carbachol dùng để loại bỏ toàn bộ nội bào trên vòng mạch đã đƣợc gây co bằng 0.3-1mM phenylephrine. Rửa với dung dịch muối sinh lý, gây co vòng động mạch bằng dung