Mẫu thực vật đã thu đƣợc xử lý và chiết với các dung môi methanol. Thu thập và tạo dịch chiết methanol của mẫu thực vật C – 451 Glycosmis petelotii; 5 mẫu phân bố trong các dung môi khác nhau của mẫu thực vật trên.
Theo danh mục dịch chiết các mẫu thực vật nó là mẫu C -451 với VIP-Code là VIP-0011, các dịch chiết phân bố trong các dung môi khác nhau của C – 451 liệt kê tại bảng sau:
Bảng 2.1. Các dịch chiết phân bố trong các dung môi khác nhau của C – 451
ST
T Đối tƣợng Ký hiệu mẫu lƣu
VIP-Code
1
Dịch chiết methanol
G.petelotii C-451 VIP-0011
2 Phân đoạn n-Hexane C-451H VIP-0011-H
3 Phân đoạn Clorofom C-451C VIP-0011-C
4 Phân đoạn Etylaxetat C-451E VIP-0011- E
5 Phân đoạn Butanol C-451B VIP-0011- B
6 Phân đoạn Metanol –
nƣớc C-451W VIP-0011- W
2.2.2.2. Thử hoạt tính tim mạch: a. Hóa chất
Dung dịch muối sinh lý chuẩn PSS chứa (mM): NaCl 125, KCl 5, CaCl2 2.7, MgSO4 1, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, và glucose 11 có pH 7.35. Dung dịch PSS chứa HEPES chứa mM: NaCl 130, KCl 5.6, HEPES 10, glucose 20, MgCl2.6H2O 1.2, và Napyruvate 5; pH 7.4. Dịch muối sinh lý Krebs–Henseleit PSS chứa (mM): NaCl 124, KCl 4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.1, KH2PO4 0.4, NaHCO3 25 và glucose 5.5. Duy trì tại 37oC thổi khí thành phần 95% O2 và 5% CO2. PSS chứa 60mM KCl đƣợc điều chế bằng cách thay thành phần NaCl bằng lƣợng tƣơng đƣơng KCl.
40
b. Động vật thí nghiệm
Tất cả động vất thí nghiệm đƣợc chăm sóc và thực nghiệm theo Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85–23, revised 1996) và phù hợp với Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của trƣờng Đại học Siena, Italy.
Chuột đực Sprague-Dawley (300-400g, nguồn Charles River Italia, Calco,
Italy) bị gây mê (qua ven i.p.) bằng hỗn hợp Ketavet (30 mg/kg ketamine; Intervet,
Aprilia, Italy) và Xilor1 (8 mg/kg xylazine; Bio 98, San Lazzaro, Italy), bị cắt đầu và rút hết máu.
Có 2 cách lấy động mạch chuột thí nghiệm.
- Lấy động mạch đuôi chuột: Đuôi chuột bị cắt khỏi thân, loại bỏ da và bảo dƣỡng trong dung dịch muối sinh lý (chứa mM: 125 NaCl, 5 KCl, 2.7 CaCl2, 1 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, and 11 glucose; pH 7.35) hoặc trong dung dịch ngoài (chứa, mM: 130 NaCl, 5.6 KCl, 10 HEPES, 20 glucose, 1.2 MgCl2_6 H2O, and 5 Napyruvate; pH 7.4). Động mạch chủ đuôi chuột đƣợc gỡ ra không bị dính các mô liên kết.
- Lấy động mạch cổ-bụng: Sau khi rút hết máu, mở lồng ngực, cắt bỏ phổi và tim để làm lộ động mạch. Đây là giai đoạn quan trọng vì có các thụ cảm dọc theo thành động mạch. Chọn lấy 2cm mô mạch đoạn nối giữa ngực-bụng không bị bám mao mạch và bị bao quanh bởi các mô liên kết. Trong quá trình thao tác đoa ̣n ma ̣ch không bi ̣ kéo căng để tránh động chạm tới lớp nội bào.
Rửa hết máu trong đoạn mạch, lắc trong bình. Giữ một đầu mạch bằng kềm forceps trong nƣớc muối để bảo tồn lớp nội bào. Sau đó đoạn động mạch đƣợc đặt trong đĩa Petri (đáy bằng silicon đen), cố định cả hai đầu bằng kim gài và loại bỏ các mô liên kết bằng nhíp và kéo.
- Tiếp theo, cắt mạch thành các vòng nhỏ có độ dài 1.5-3-4mm. Vòng càng dày thì độ co càng tốt. Cho phép thử độ co gây ra bởi Phe 0.3μM thì cho phép lớp nội bào
41
vòng khoảng 4mm. Sử dụng thiết bị vi phẫu và các giấy lọc đặt trong dung dịch muối để đặt các vòng động mạch.
Đoạn mạch đƣợc bảo trì trong dung dịch sinh hóa Krebs-Henseleit (KHS: với các thành phần (mm) 118.0 NaCl, 4.7 KCl, 25.0 NaHCO3, 1.8 CaCl2, 1.2 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 11.0 Glucose), tại nhiệt độ 37oC và oxy hóa bằng carbogen 95% O2, 5% CO2.
c. Thí nghiệm gây co thắt
Thí nghiệm đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của Saponara &cs. 2012. Các dịch chiết đƣợc thí nghiệm trên các vòng động mạch đuôi chuột. Vòng mạch để cân bằng ngoài 60 phút dƣới sức nặng của một vòng dây tungsten 40μm 1.5g cho vào bên trong mặt kính lumen, dùng thủy tinh Plexi nối với một máy cảm biến (2B Biological Instruments, Varese, Italy) nối với một thiết bị ghi bằng bút (Ugo Basile, Comerio, Varese, Italy). Toàn bộ thí nghiệm đƣợc ngâm trong một bể 2 buồng thể tích 20ml, chứa dung dịch muối sinh lý ở nhiệt độ 37o
C và sục liên tục khí hỗn hợp O2/CO2 95/5(%).
Thí nghiệm với vòng động mạch loại bỏ lớp nội bào (-ER): Lớp nội bào đƣợc loại đi bằng cách luồn một sợ dây thép không gỉ vào bên trong vòng và lăn nhẹ bề mặt bên trong của thành mạch. Sau thời gian cân bằng 60phút, 1mM carbachol dùng để loại bỏ toàn bộ nội bào trên vòng mạch đã đƣợc gây co bằng 0.3-1mM phenylephrine. Rửa với dung dịch muối sinh lý, gây co vòng động mạch bằng dung dịch 60mM K+
tới khi bão hòa và cho chất thử vào.
Thí nghiệm với vòng động mạch giữ lớp nội bào (+ER): Thực hiện tƣơng tự nhƣ trên với gây co vòng động mạch bằng dung dịch 60mM K+
tới khi bão hòa và cho chất thử vào.
2.2.2.3. Thử hoạt tính gây độc (ức chế) tế bào ung thƣ in vitro (cytotoxic assay) a. Vật liệu
+ Hóa chất: do Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên cung cấp và các hóa chất
42
+ Các dòng tế bào ung thư: SK-Hep-1 (ung thƣ gan ngƣời), MCF-7 (ung thƣ vú
ngƣời) do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trƣờng Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trƣờng Đại học Milan, Italia cung cấp.
b. Nuôi cấy tế bào in vitro
Các dòng tế bào ung thƣ SK – Hep – 1 và MCF – 7 đƣợc nuôi cấy dƣới dạng đơn lớp trong môi trƣờng nuôi cấy RPMI 640 và bổ sung 10% huyết thanh bê non (GIBCO, Grand Island, NY), natri bicacbonat, penicillin G và streptomycin.
Tế bào đƣợc cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37o
C, 5% CO2.
c. Phép thử hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)
Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp sulforhodamine B (SRB). Các tế bào ung thƣ đƣợc nuôi trong phiến vi lƣợng 96 giếng, mỗi giếng 180 μL với nồng độ 4×104 tế bào/mL. Các mẫu đánh giá đƣợc hoà tan trong DMSO 10% đến nồng độ 100μg/mL. Các mẫu này đƣợc chia làm 3 lần. Nồng độ DMSO cuối cùng đƣợc điều chỉnh nhỏ hơn 0,1%. Phép thử kéo dài trong 3 ngày. Một phiến vi lƣợng để trống xem nhƣ là mẫu so sánh 0 ngày. Các phiến còn lại đƣợc ủ trong môi trƣờng ẩm chứa 5% CO2 trong 72h. Trong khi đó phiến 0 ngày đƣợc ủ trong 1h. Sau khi ủ xong, quay cất dịch, thu đƣợc các tế bào ung thƣ.
Các tế bào ung thƣ còn lại ở phiến 0 ngày đƣợc trộn với tricloroaxetic 10% (TCA) khoảng 1h ở 4o
C. Còn các tế bào ung thƣ ở các phiến còn lại đƣợc trộn với tricloroaxetic 70% (TCA) khoảng 2h ở 4oC. Các tế bào ung thƣ sau khi xử lí với TCA đƣợc rửa nhiều lần với nƣớc và làm khô bằng không khí. Sau đó, thêm vào mỗi phiến 50μl dung dịch SRB (0,4% trong CH3COOH) ở nhiệt độ phòng. Sau khi để yên khoảng 1h, các phiến đƣợc rửa 3-4 lần với CH3COOH 1% và làm khô bằng không khí. Quá trình nhuộm chỉ thực hiện duy nhất 1 lần bằng cách thêm vào 10 mmol Tris base không đệm. Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc đo ở bƣớc sóng 520 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad). OD đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng làm chất đối chƣ́ng chuẩn.
43 % 100 . 1 % C T CI
Trong đó: T, C là mâ ̣t đô ̣ quang của mẫu thƣ̉ và mẫu trắng tƣơng ƣ́ng.
2.2.2.4. Thử sàng lọc trên Wnt/b-catenin signalling pathway: a. Quá trình tạo Wnt /β – catenin (Wnt/ β – catenin pathway)
Các protein – Wnt, tên wnt đƣợc ghép tƣ̀ (Wg) tƣ̀ mô ̣t loa ̣i ruồi không cánh
Drosophila Wingless và gen Int – 1 của chuột , là một nhóm protein có vai trò rất
quan tro ̣ng trong cả sƣ̣ phát triển và chết cuả tế bào . Họ các protein Wnt là các protein giầu cystein và cho đến nay chƣa đƣợc khám phá nhiều . Các nghiên cứu sinh ho ̣c phân tƣ̉ hiê ̣n đa ̣i ngày nay đã phát hiê ̣n thấy protein Wnt lien quan đến nhiều hoa ̣t đô ̣ng của tế bào nhƣ sƣ̣ sinh trƣởng của phôi tế bào, sƣ̣ biê ̣t hóa, sống và chết của tế bào.
Quá trình tạo Wnt đƣợc phát hiện lần đầu năm 1982 khi Nusse thấy chú ng trong các khối ung thƣ của chuô ̣t . Kể tƣ̀ đó các nhà khoa ho ̣c trên thế giới đã phát hiện thấy sự liên quan của “Wnt signaling pathway” đến nhiều loại bệnh nhƣ ung thƣ, tim ma ̣ch, lão hóa, tiểu đƣờng, thần kinh và viêm nhiễm . Các protein Wnt có khối lƣơ ̣ng phân tƣ̉ giao đô ̣ng trong khoảng tƣ̀ 39 – 46 kDa và chƣ́a tƣ̀ 350 – 400 đơn vi ̣ axit amin.
Quá trình tạo Wtn hiện nay đƣợc phân biệt thành hai dạng : canonical và non - canonical. Quá trình canonical – Wnt điều khiển sƣ̣ phiên mã gen qua β – catenin. Ngƣời ta đã phát hiê ̣n thấy hơn 90% ung thƣ ruô ̣t kết (colon cancer) có di căn liê n quan đến quá trình ta ̣o canonical – Wnt, thể hiê ̣n ở chỗ có sƣ̣ ta ̣o thành và tích tu ̣ β – catenin trong tế bào ung thƣ.
Các β – catenin là mô ̣t thành phần chủ y ếu trong liên kết giƣ̃a hai tế bào và quá trình Wnt/ β – catenin, chúng đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào , hình thành tế bào, tính chất tế bào, quá trình sống và chất của tế bào.
Lƣợng β – catenin nô ̣i bào là chìa khóa khống chế quá trình Wnt / β – catenin, đƣơ ̣c điều chỉnh bằng quá trình suy giảm proteasome phu ̣ thuô ̣c vào phosphoryl hóa. Các enzyme casein kinase 1 (CK 1) và GSK - 3β xúc tác liên tu ̣c cho quá trình
44
Phosphoryl hóa β – catenin ở các protein S er45, Thr41, Ser33. Đồng thời, các hệ protein/enzyme nhƣ PKA/GSK-3β, CDK2/cylinE và PKCα phosphoryl hóa các hợp phần chƣ́a Nitơ của β – catenin. Vì vậy, trong tế bào bình thƣờng , β – catenin nô ̣i bào thƣờng xuyên đƣơ ̣c duy trì ở mƣ́c thấp.
b. Nguyên liê ̣u và hóa chất:
Các tế bào HEK 293, HCT-116, SW480, DDL-1, LS174T và Wnt 3a đƣơ ̣c mƣa mua tƣ̀ hãng American Type Culturen Collection và duy trì trong DMEM chƣ́a 10% SBS huyết tƣơng bò (fetal bovine serum), 120μg/ml streptomycin. Các tế bào HEK293 (TOPFlash), chất chuẩn (FOPFlash), và tế bào chỉ thị HEK293 (SEAP) đƣơ ̣c chuẩn bi ̣. Môi trƣờng nuôi cấy Wnt3a (Wnt3a-CM) đƣợc chuẩn bi ̣ trƣớc, phép thƣ̉ Luciferase đƣợc thƣ̣c hiê ̣n với kít thƣ̉ Dual Lucif erase Assay Kit (promega). Phép thử sự tiết của enzyme alkaline phosphatase đƣợc thực hiện với kít sinh học Phospha-Light Assay củ a hãng Applied Biosystems . LiCl và MG -132 đƣơ ̣c mua tƣ̀ Sigma-Aldrich.
b. Thực hiê ̣n:
Tế bào HEK293 ( TOPFlash) trong môi trƣờng nuôi cấy đƣơ ̣c cho vào bản 96 giếng với nồng đô ̣ 15,000 tế bào/ giếng và để phát triển trong 24 giờ (lă ̣p la ̣i 2 lần). Sau đó , Wnt3a-CM đƣợc thê m vào . Cuối cùng các hợp chất tƣ̣ nhiên đã pha sẵn đƣơ ̣c cho vào mỗi giếng.
2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc 2.3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất MC-340
MC – 340 (chất mới)
Tên thông thƣờng: Demethylglypetelotine
Tên IUPAC: S-methyl N,N-2-[(1H)-indol-3-ethyl]-thiocarbamate, CTPT: C12H14N2OS
• Tinh thể hình kim, màu trắng xanh, tan đƣợc trong clorofom, axeton. • Phổ 1
H-NMR (Axeton-d6, 500 MHz), (ppm): 10,02 (1H; s; H-1); 7,60 (1H;
d; 8,0 Hz; H-4); 7,38 (1H; d; 8,5 Hz; H-7); 7,29 (1H; br.s; H-3’); 7,17 (1H; br.s; H- 2); 7,09 (1H; t; 7,5 Hz; H-6); 7,02 (1H; t; 7,5 Hz; H-5); 3,55 (2H; dt; 6,5; 6,5 Hz; H- 2’); 2,97 (2H; t; 7,5 Hz; H-1’); 2,27 (3H; s; H-6’),
45 • Phổ 13 C-NMR (Axeton-d6, 125 MHz) (ppm): 167 (s; C-4’; yếu); 137,7 (s; C- 8); 128,5 (s; C-9); 123,4 (d; C-2); 122,1 (d; C-6); 119,4 (d; C-5); 119,2 (d; C-4); 113,1 (s; C-3); 112,1 (d; C-7); 42,7 (t; C-2’); 26,4 (t; C-1’); 11,9 (q; C-6’) • Phổ HR-ESI-MS: 235,09017 ([M+H]+); 187,08677 ([M+H-CH3SH]+)
• Phổ IR: 3420,99 cm-1νN – H ( đỉnh có vai phụ : N – H của nhân indol , và N –H
ở vị trí 3’), 3057 cm-1
ν=CH ( của vòng thơm) , 1678 cm-1 νC=O , 1590 cm-1 δNH ( của amit), 1467
cm-1 δCH, 1104 cm-1 νCO – S , 730 cm-1 νC – S , 2222,72 cm-1
2.3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất MC-339 ( trùng MC-308)
MC-339 (trùng MC-308): Tên thông thƣờng: glypetelotine
Tên IUPAC: S-methyl N,N-2-[(1H)-indol-3-ethyl]-methyl-thiocarbamate, CTPT: C13H16N2OS
• Tinh thể hình vẩy, màu trắng ngà, hoặc hình khối không màu, tan đƣợc trong clorofom, axeton.
• Phổ ESI-MS (+): 272.1 ([M+Na]+); HR-ESI-MS (+): 272.09019 ([M+Na]+),
201.10204 ([M-CH3SH]+). • Phổ 1 H-NMR (Axeton-d6, 500 MHz), (ppm): 10,05 (1H; s; H-1); 7,67 (1H; d; 7,5 Hz; H-4); 7,39 (1H; d; 8,0 Hz; H-7); 7,19 (1H; br.s; H-2); 7,11 (1H; t; 7,5 Hz; H-6); 7,04 (1H; t; 7,5 Hz; H-5); 3,66 (2H; br.d; H-2’); 2.98 (2H; br.d; H-3’); 2,29 (3H; s; H-7’). • Phổ 13 C-NMR (Axeton-d6, 125 MHz) (ppm): 168.2 (s; C-4’); 137,7 (s; C-8); 128,5 (s; C-9); 123,4 (d; C-2); 122,2 (d; C-6); 119,5 (d; C-5); 119,2 (d; C-4); 112,8 (s; C-3); 112,2 (d; C-7); 51,1 (t; C-1’); 24,2 (t; C-2’); 12,8 (q; C-6’).
2.3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GPH1
GPH1
CTPT: C29H50O
Tên thông thƣờng: β-Sitosterol
Tên IUPAC: 17-(5-Ethyl-6-methylheptan-2-yl)-10,13-dimethyl-
2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol. • Là tinh thể hình kim, màu trắng ngà, tan tốt đƣợc trong metanol.
• Nhiê ̣t đô ̣ nóng chảy 140 – 145o C • Phổ 1 H – NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 0,68 (3H; s; CH3-18); 1,01 (3H; s; CH3-19); 0,81 (3H; d;7,7 Hz;CH3-26); 0,88 (3H;d; 7,7Hz; CH3-27); 0,84 (3H; t; 7,3 Hz; CH3 -29); 0,92 (3H; d; 10Hz; CH3-21); 3,53 (1H; m; H-3α); 5,35 (1H, d, 5,5 Hz, H -6 )
2.1.4.Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của hợp chất GPH2
CTPT: C18H34O2
Tên thông thƣờng: axit oleic
46
• Là chất lỏng nhƣ dầu, màu vàng nhạt, ít tan trong nƣớc, tan trong n - Hexan. • Nhiê ̣t đô ̣ nóng chảy 13 – 14o
C • Phổ 1
H – NMR ( 500 MHz, CDCl3) : (ppm): 0,88 (3H;t; CH3-18); 1,63 (2H; m; H -17); 2,00 và 2,01 (2x2H; d; H-8 và H -11); 2,34 (2H; t; H-2); 5,34 (2H, m, H
47
CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập
Từ cành và lá cây cơm rƣợu (Glycosmis petelotii) thu đƣơ ̣c các chất GPH1 ( β-
Sitosterol) , GPH2 ( Axit oleic) trong di ̣ch phân bố bằ ng dung môi n-Hexan, MC–
340 (DemethylGlypetelotine) và hai dạng kết tinh khá c nhau củ a cùng 1 chất MC–
308 (MC–339) (Glypetelotine)
3.1.1.Hợp chất MC- 340 :
Hợp chất MC – 340 thu đƣợc dƣới da ̣ng tinh thể hình kim dài , màu trắng xanh tan đƣợc trong clorofom, axeton.
Phổ 1H và 13C-NMR, DEPT cho ta biết hợp chất MC – 340 có 1 nhóm methyl (CH3-), hai nhóm met hylen (-CH2-), năm nhóm methin thơm (=CH-), 4 cacbon không có liên kết với hydro (bâ ̣c 4).
Hình 3.1.a: phổ 1
48
Phân tích phổ giãn 1H – NMR (hình 3.1.b) của hợp chất MC – 340 cho thấy rõ hợp chất có một nhóm methyl singlet ở δ 2,27; hai nhóm met hylen ở δ 3,56 (dt; 6,5; 6,5 Hz) và 2,97 (t; 7,5 Hz). Vùng thơm có 4 tín hiệu proton, trong đó có 2 tín hiệu duplet và 2 tín hiệu triplet, bao gồm proton a (7,60; 1H; d; 8,0 Hz), b (7,38; 1H; d; 8,5 Hz), d (7,09; 1H; t; 7,5 Hz), và proton e(7,02; 1H; t; 7,5 Hz), cho phép dƣ̣ đoán 4 proton này thuô ̣c vòng benzene thế 1,2. Ngoài ra còn mô ̣t nhóm CH thơm singlet c (7,17; 1H; br.s); một tín hiê ̣u rô ̣ng , đơn ở gần δ 7,3 cho dƣ̣ đoán là của proton nhóm OH hoă ̣c NH , mô ̣t tín hiê ̣u đơn cƣờng đô ̣ thấp ở δ 10,02 (hình 3.1.a). Phổ 13
C – NMR và DEPT khẳng đi ̣nh phân tƣ̉ có 5 nhóm CH thơm , 2 nhóm methylen và 1 nhóm methyl . Ngoài ra cũng thông qua phổ 13C – NMR và DEPT (hình 3.1.c và hình 3.1.d) còn phát hiện trong phân tử MC – 340 còn có 3 cacbon thơm không có liên kết với hydro ở δ 113,1; 137,7 và 128,5.
Hình 3.1.b: phổ giãn 1
49
Hình 3.1.c: phổ 13
C- NMR của MC – 340
Hình 3.1.d: phổ DEPT của MC – 340
Phổ HSQC cho phép xác định liên kết trực tiếp giữa pro ton và cacbon . Kiểm tra phổ giãn HSQC ở vùng thơm ta thu đƣợc kết quả theo bảng 3.1.
50
Hình 3.1.e: phổ HSQC đầy đủ của MC – 340
51
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MC-340
Vị trí δC(ppm) δH(ppm) HMBC (HC) ROESY (HH) 1 10,02 (1H; s) 2 123,4 (d) 7,17 (1H; br.s) C-3; C-8; C-9 3 113,1 (s) 4 119,2 (d) 7,60 (1H; d; 8,0 Hz) C-3; C-6; C-8 H-6 5 119,4 (d) 7,02 (1H; t; 7,5 Hz) C-7; C-9 6 122,1 (d) 7,09 (1H; t; 7,5 Hz) C-4; C-8 H-4 7 112,1 (d) 7,38 (1H; d; 8,5 Hz) C-5; C-9 8 137,7 (s) 9 128,5 (s) 1’ 26,4 (t) 2,97 (2H; t; 7,5 Hz) C-2; C-3; C-9; C- 2’ H-2’ 2’ 42,7 (t) 3,56 (2H; dt; 6,5; 6,5 Hz) C-3; C-1’; C-4’ H-1’ 3’ 7,29 (1H; s) 4’ 167 (s)