Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập đư- 123docz.net

1. 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây Hedychium coronarium tại Việt Nam

3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được

3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7

Hợp chất P7 là tinh thể hình kim, màu trắng, điểm nóng chảy 124oC và Rf= 0,65 ( n- hexan/EtOAc, 7/3,v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH = 4) khi đun nóng. Phổ IR của P7 (xem phụ lục số 4 trang 76 ) cho thấy có vòng - lacton , không no (C=O 1751 cm-1, và liên kết đôi 3 nhóm thế có C=C 1643 cm-1, C-H =829 cm-1); có liên kết đôi 2 nhóm thế dạng E ( exo – metylen) với C=C 1603 cm-1, C-H 900 cm-1.

Trên phổ 13 C – NMR và DEPT ( xem phụ lục số 7,8 trang 79,80) cho thấy rõ phân tử P7 có 20 nguyên tử C, trong đó có 3 nhóm metin olefin vùng trường yếu 120 – 145 ppm, 2 nhóm metin của Cacbon bậc 3 no vùng 55 – 65 ppm, 6 nhóm metylen và đặc biệt nhóm exo metylen có C = 108,40 ppm.

Khối phổ của P7 cho pic M+

= 300,6 (xem phụ lục số 5 trang 77). Từ các số liệu trên suy ra công thức phân tử của P7 là C20H28O2 và độ bội liên kết là 7. Vì phân tử hợp chất P7 có 20 nguyên tử cacbon, có vòng - lacton , không no, nhóm exo – metylen vì 3 nhóm metyl ở vùng trường mạnh nên có thể suy ra đây là diterpen và dựa vào qui luật đầu đuôi và đặc điểm các phổ chúng tôi xây dựng khung labdan. Những dữ kiện trên cho phép khẳng định P7 là Villosin có công thức như hình 3.1. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR được chỉ ra trong bảng 3.6. Số liệu phổ cũng như điểm chảy của P7 tương ứng với số liệu phổ và điểm chảy của villosin công bố trong tài liệu 25.

58 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1 H và 13C-NMR của hợp chất P7 Vị trí C C (ppm) của P7 C (ppm) của villosin [25] H (ppm) của P7 Độ bội, J(Hz) của P7 H (ppm) của villosin [25] 1 40,83 40,9 1,00; 1,40 m 1,00; 1,45 2 19,11 19,1 1,49; 1,46 m 1,40; 1,51 3 42,30 42,3 1,51; 1,21 m 1,18; 1,40 4 33,57 33,6 5 54,75 54,8 1,09 dd(2,68; 2,68) 1,09 6 23,38 23,4 1,71; 1,38 m 1,71; 1,39 7 36,75 36,8 2,45; 2,08 m 2,08; 2,44 8 149,40 149,4 9 62,22 62,2 2,37 m 2,37 10 39,29 39,3 11 136,87 136,9 6,89 dd(10,13; 10,13) 6,90 12 120,66 120,7 6,10 d (15,84) 6,11 13 129,55 129,6 14 142,34 142,3 7,14 br_s 7,15 15 69,56 69,6 4,8 d(1,6) 4,80; 16 172,31 172,3 17 108,40 108,4 4,5; 4,76 d(1,7); d(1,7) 4,51; 4,76 18 33,38 33,6 0,89 s 0,89 19 21,93 22,0 0,84 s 0,84 20 15,05 15,1 0,87 s 0,87

3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất P5

Hợp chất P5 là chất rắn vô định hình, không màu. Phổ IR (xem phụ lục 11 trang 83) cho thấy nhóm - OH (OH 3636 cm-1), vòng - lacton (C=O 1758 cm-1), nhóm exo -

metylen (3088, 1674 và 948 cm-1) và liên kết đôi 3 nhóm thế (1674, 948 cm-1). Phổ

C-NMR (xem phụ lục 14 trang 86)cho thấy có 20 nguyên tử cacbon trong phân tử, trong đó có nhóm cacbonyl (170,50 ppm), 4 cacbon olefinic (148,25, 143,48, 124,44 và 108,07 ppm), 3 nhóm metin, 8 nhóm metylen và 3 nhóm metyl. MS cho pic phân tử lượng 318(xem phụ lục 12 trang 84). Các số liệu trên cho phép xác định công thức phân tử P5 là C20H30O3. Phổ 1H-NMR một lần nữa khẳng định có nhóm vinyliden trong phân tử P5 thể hiện ở 2 proton geminal ở 4,83 ppm (1H, d, J 18.1) và 4,37 (1H, d, J 18.2). (xem phụ lục 13 trang 85) Kết luận này dựa trên sự tương tác của các proton lên cacbon có C =108,07 ppm qua phổ HSQC (xem phụ lục 16 trang 88). Phổ 1H&

C-NMR cho thấy có một liên kết đôi 3 nhóm thế thể hiện H = 6,72 ppm (1H,br_s) và

C = 143,48 ppm. Từ các số liệu trên chúng ta có công thức cấu tạo của P5 (hình 3.2) và các số liệu 1H và 13C-NMR trong bảng 3.7

60 Bảng 3.7: Số liệu 1 H&13C-NMR của hợp chất P5 Vị trí C C (ppm) của P5 C (ppm) của coronarin D [11] H (ppm) của P5 Độ bội, J(Hz) của P5 H (ppm) của coronarin D [11] 1 39,46 39,12 1,55; 1,15 m 2 19,25 19,21 1,49; 1,55 m 3 41,93 41,90 1,50; 1,2 m 4 33,61 33,57 5 55,25 55,21 1,16 dd(2,36; 2,36) 1,13 6 24,62 24,42 1,32 m 7 37,72 37,68 1,73 m 8 148,25 148,01 9 56,07 56,02 3,01 1H 2,99 10 39,66 39,94 11 24,00 23,99 2,36-2,39 m,(2H) 2,36-2,40 12 143,48 143,45 6,72 br s,1H 6,69 13 124,44 124,48 14 25,42 25,58 2,71 s,1H 2,71 15 96,42 96,46 5,94 br_s,1H 5,94 16 170,57 170,65 17 108,07 107,52 4,83; 4,37 4,81; 4,36 18 20,98 21,62 0,88 s,3H 0,89 19 19,25 19,21 0,81 s,3H 0,82 20 14,02 14,23 0,71 s,3H 0,71

Ghi chú: Số liệu phổ trên bảng 3.7 phù hợp với tài liệu (11,17)

Như vậy P5 có tên hóa học là 15-hydroxy-8(17),12-labdadien-15(16)-olide và có tên khác là coronarin D. Sự định hướng của các proton H9, H5, C20 được khẳng định nhờ xét sự tương tác của chúng qua phổ NOESY( xem phụ lục 18 trang 90)

3.3.4.3. Xác định cấu trúc phân tử H6

Hợp chất H6, dạng dầu không màu, Rf =0,5 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4).

Phổ IR của H6 (xem phụ lục 19 trang 91) cho thấy phân tử có một vòng - lactone có vị trí , - chưa no có C=O 1762 cm-1 và C=C 1681 cm-1; nhóm exo-

methylene C=C 1641 cm-1 , C-H 954 cm-1 và nhóm ete C –O-C = 1118cm-1

Phổ 1HNMR ( phụ lục 21 trang 93) cho thấy sự hiện diện của 2 nhóm Etoxy, hiển thị bởi hai cụm triplet (H = 1,12 ppm và H = 1,15 ppm ) và pic multiplets (H =3,59 ppm; H =3,86ppm) tín hiệu của các nhóm methyl (H = 0,68 ppm; 0,78ppm; và 0,85ppm) và H của exo-methylene (H = 4,32ppm; 4,37ppm và 4,77ppm).

Quan sát những phổ 13C – NMR (xem phụ lục số 22a trang 94) cho thấy 8 Cacbon olefin vùng 107 – 147 ppm là 4 cặp đôi cacbon olefin liền kề có cùng cường độ. Tổng số cacbon của hai đồng phân này là 44. Trong đó có 8 nhón CH, 16 nhóm CH2, 8 nhóm CH3 (xem phổ DEPT, phụ lục 23 trang 97). Đặc điểm phổ nêu trên gần với phổ của Coronarin D như đã xác định ở 3.3.4.2.

Tất cả các dữ kiện trên cho phép nghĩ đến đây là cặp đồng phân epime của etyl coronarin D ete.

Điều này được khẳng định thêm nhờ trên phổ khối của H6 (xem phụ lục 20 trang 92) có pic ion phân tử tại m/z = 346,4 (M+) , cùng với 1 phân mảnh có điểm ion m/z = 300,6 (M+ – C2H5OH). Tất cả thỏa mãn với công thức phân tử C22H34O3.

Số liệu phổ của H6 được ghi trên bảng 3.8 và công thức cấu tạo của H6 được chỉ ra trên hình.

62 H O O 22 O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Hình 3.3. Công thức cấu tạo của H6 – etyl coronarin D ete Bảng 3.8. Số liệu phổ 13C của hợp chất H6 Nguyên tử C

Số liệu phổ 13C của hợp chất H6

Số liệu phổ 13C của epimer Etyl coronarin D ete[33] H6/a H6/b 3a 3b 1 39,19 39,35 39,2 39,3 2 19,231 19,231 19,3 19,3 3 41,919 41,919 42,0 42,0 4 32,844 32,798 33,6 33,6 5 55,300 55,253 55,3 55,4 6 24,020 23,999 24,1 24,1 7 37,704 37,704 37,8 37,8 8 147,732 147,975 147,8 148,1 9 56,056 56,056 56,1 56,1 10 39,348 39,197 39,4 39,4 11 25,327 25,327 25,4 25,4 12 142,572 142,700 142,9 143,0

63 13 124,148 124,079 124,1 124,1 14 32,844 32,798 32,9 32,9 15 100,934 100,934 101,0 101,0 16 169,604 169,604 169,8 169,8 17 107,249 107,560 107,3 107,7 18 33,308 33,458 33,6 33,6 19 21,630 21,540 21,7 21,7 20 14,003 14,230 14,3 14,4 21 65 65 65,1 65,1 22 14,260 14,849 15,0 15,0

Để khẳng định thêm độ chính xác dự đoán cấu tạo là hỗn hợp epime của etyl coronarium D, chúng tôi kết hợp so sánh dữ liệu phổ 13C của H6 với tài liệu 33. Bảng số liệu trên cho thấy sự phù hợp của phổ 13

C- NMR của cặp epimer của etyl coronarin D ete mà Taveira và cộng sự, năm 2005 đã phân lập và xác định cấu trúc từ thân rễ cây ngải tiên ( Hedychium coronarium J. Koening) của Braxin[33].

3.3.5. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của các chất phân lập được từ thân rễ ngải tiên. ngải tiên.

Như trên đã trình bày ở trên, chúng tôi đã phân lập được 6 chất tinh khiết trong thân rễ cây ngải tiên vùng Sapa. Ba trong số đó đã được xác định cấu trúc phân tử một cách chặt chẽ bằng các phương pháp phổ hiện đại, đó là: Villosin; Coronarin D và epimer của Etyl coronarin D ete.

Villosin là một chất có hoạt tính chống ung thư phổi rất mạnh. Các nghiên cứu của Kumrit I và cộng sự đã khẳng định Villosin chống ung thư phổi mạnh hơn so với thuốc chống ung thư phổi nổi tiếng ellipticine. Cường độ IC50 của villosin là 0,40 M, cao hơn so với các thuốc ellipticine (IC50 1,79 microM). Hơn nữa, villosin không độc

với tế bào Vero trong khi ellipticine rất độc hại đối với tế bào này. Chính vì vậy mà villosin có triển vọng trong sự phát triển thuốc điều trị ung thư [16].

Coronarin D và etyl coronarin D đã có nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính chống ung thư. Các loại ung thư như: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi A 549, ung thư thần kinh SK – N – SH, ung thư vú MCF – 7, ung thư cổ tử cung HeLa [17, 32] đã được thử nghiệm. Nhưng các dòng ung thư phổi Lu, ung thư cơ vân tim RD chưa được thử nghiệm. Chúng tôi khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Coronarin D phân lập được từ thân rễ cây ngải tiên vùng Sapa với 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1993), Likhiwitayawuid và cộng sự (1993); các phương pháp này hiện nay đang được áp dụng tại viện ung thư quốc gia của Mỹ (NCI). Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.8 và bảng 3.9.

Bảng 3.8. Hàm lƣợng tế bào ung thƣ sống sót sau khi thử TT Ký hiệu mẫu Các tế bào còn sống sót CS (%) Kết luận Hep-G2 Lu RD 1 DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0 100,0±0,0 P5 dương tính tính cả 3 dòng 2 Chứng (+) 2,2±0,0 1,8±0,04 0,30±0,03 3 P5 0,0±0,0 19,4±0,10 0,00±0,00

Bảng 3.9. Cƣờng độ gây độc tế bào ung thƣ TT Ký hiệu mẫu Nồng độ gây độc IC50 (g/ml) Kết luận Hep-G2 Lu RD 1 Chứng (+) 0,257 0,312 0,188 P5 dương tính cả 3 dòng 2 P5 0,788 0,969 0,675

Từ kết quả bảng trên cho thấy, mẫu P5 (Coronarin D) mà chúng tôi phân lập được có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh đối với cả 3 dòng ung thư người là ung

thư gan Hep-G2 ( IC50 0,78 microgam/ml), ung thư phổi Lu(IC50 0,96 microgam/ml) và ung thư cơ vân tim RD ( IC500,67 microgam/ml).

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig), chúng tôi đã có kết luận sau:

1. Đã xây dựng phương pháp và thiết bị điều chế tinh dầu thân rễ cây ngải tiên vùng Sapa cho hiệu suất cao (0,12% so với mẫu tươi) trong khi tinh dầu thu từ củ cây ngải tiên trồng ở Từ Liêm cho hiệu suất 0,09% so với mẫu tươi .

2. Bằng phương pháp GC - MS đã xác định thành phần hóa học có hàm lượng cao trong tinh dầu ngải tiên là: Linalool: 23,44%; α-Terpineol: 12,14%; Nerolidol : 11,86%; 1,8- cineole 2.23%; Terpinen-4-ol: 2.12%. Kết quả phân tích cho thấy thành phần tinh dầu ngải tiên Sapa khác tinh dầu ngải tiên trồng thực nghiệm tại Từ Liêm nhiều.

3. Xây dựng quy trình chiết chọn lọc các hợp chất  - lacton ,  không no thuộc dãy labdan – điterpen trong thân rễ cây ngải tiên cho hiệu quả tốt.

4. Chúng tôi đã phân lập được 5 hợp chất tinh khiết từ cặn EtOAc và 1 chất từ cặn

n – hexan của thân rễ ngải tiên và đã xác định cấu trúc phân tử của 3 hợp chất. Đó là: Villosin; Coronarin D và epimer của ete etyl coronarin D.

5. Chúng tôi đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 3 mẫu: tinh dầu, cặn H và cặn E. Kết quả cho thấy tinh dầu kháng được ba loại vi khuẩn: Ecoli và 2 loại vi khuẩn nấm mốc: Asp.niger và F.oxysporum; còn cặn H và cặn E đều cho kháng F.oxysporum.

6. Chúng tôi cũng đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Coronarin D phân lập từ thân rễ cây ngải tiên Sapa đối với 3 dòng tế bào ung thư người: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi Lu và ung thư cơ vân tim RD và nhận thấy Coronarin D có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với cả 3 dòng ung thư trên.

Chúng tôi đã công bố một phần kết quả của luận án trong bài báo trên tạp chí Dược Học, năm 2012, số 429, trang 48 - 52.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nxb KH&KT Hà Nội, tr. 141-143.

2. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội, tr. 141.

3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, TP HCM, tr. 821.

4. Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, NXB Montreal, tập 3, tr. 558 – 562.

5. Nguyễn Thị Thuỷ, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trương Anh Thư, Bùi Văn Thanh (2003)― Thành phần hoá học của tinh dầu Ngải tiên (Hedychium coronarium

Koenig)‖, Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật, Viện KH& CNVN.

TIẾNG ANH

6. Aziz M. A., Habib M. R., Karim M. R., (2009) ― Antibacterial and Cytotoxic Activities of Hedychium coronarium J. Koenig‖ , Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(6), pp. 969-972.

7. Boukouvalas J., Wang Jian-Xin and Marion O., (2007) ― Expedient synthesis of villosin and its isomer (E)-labda-8(17),12,14-trien-15(16)-olide‖,

Tetrahedron Letters,48, pp. 7747–7750.

8. Chimnoi N, Pisutjaroenpong S, Ngiwsara L, Dechtrirut D, Chokchaichamnankit D, Khunnawutmanotham N, Mahidol C, Techasakul S., (2008) ― Labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Natural Product Research, 22(14),pp. 1249–1256.

9. Csurhes, S., Jones M.N, (2008) Pest plant risk assessment, Biosecurity Queensland Department of Primary Industries and Fisheries, Queensland , pp. 8.

10. Itokawa H, Morita H, Katou I, et al. (1987) ― Cytotoxic diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Planta Med,54, pp. 311.

11. Itokawa H, Morita H, Takeya K, Motidome M.(1988) ― Diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull Tokyo,36, pp. 2682–4,54, pp. 311–5.

12. Joshi S, Chanotiya CS, Agarwal G, Prakash O, Pant AK, Mathela CS, (2008) ― Terpenoid Compositions, and Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Rhizome Essential Oils of Different Hedychium Species‖, Chemistry & Biodiversity, 5, p. 299.

13. Joy, P. P., Thomas J., Mathew, S., and Skaria, B. P., (1998), Zingiberaceous Medicinal and Aromatic Plants, Aromatic and Medicinal Plants Research

Station, Odakkali, Asamannoor P.O.,Kerala, India, pp. 23 – 24.

14. Joy B, Rajan A, Abraham E., (2007) ― Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from Hedychium coronarium‖, Phytother Res, 21(5), pp. 439 – 443.

15. Phan Van Kiem , Nguyen Thi Kim Thuy , Hoang Le Tuan Anh , Nguyen Xuan Nhiem , Chau Van Minh , Pham Hai Yen , Ninh Khac Ban , Dan Thuy Hang, Bui Huu Tai, Nguyen Van Tuyen , Vivek Bhakta Mathema , Young- Sang Koh , Young Ho Kim, (2011) ― Chemical constituents of the rhizomes of Hedychium coronarium and their inhibitory effect on the pro- inflammatory cytokines production LPS- stimulated in bone marrow-derived dendritic cells‖ , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,21 pp. 7460– 7465

16. Kumrit I, Suksamrarn A, Meepawpan P, Songsri S, Nuntawong N., (2010) ―Labdane-type diterpenes from Hedychium gardnerianum with potent cytotoxicity against human small cell lung cancer cells‖, Phytother Res , 24(7), pp. 1009-13.

17. Kunnumakkara AB, Ichikawa H, Anand P, Mohankumar CJ, Hema PS, Nair MS, Aggarwal BB., (2008) ―Coronarin D, a labdane diterpene, inhibits both constitutive and inducible nuclear factor-kappa B pathway activation, leading to potentiation of apoptosis, inhibition of invasion, and suppression of osteoclastogenesis‖, Mol Cancer Ther,7 (10), pp. 3306-17.

18. Li R. and Fan Y., (2011) ―Molecular Cloning and Expression Analysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium‖, Plant Molecular Biology Reporter, 29, pp. 35–42.

19. Liu X.H., Zhao D.B., Yang C.R., Wang H.Q., (2000) ―New Sesquiterpenoids from Hedychium yunnanense Gagne‖,Chinese Chemical Letters,11(11), pp. 1009−1012.

20. Lu Y., Zhong C. X., Wang L., Lu C., Li X. L. and Wang P. J., (2009), ―Anti- inflammation activity and chemical composition of flower essential oil from

Hedychium coronarium‖, African Journal of Biotechnology,8 (20), pp 5373- 5377.

21. Mabbertey D.J., (1998), The Plant-Book: A Portable Dictionary of the Higher Plants, Cambridge University Press, Cambridge

22. Matsuda H., Morikawa T., Sakamoto Y., Toguchida I. and Yoshikawa M., (2002) ― Labdane-type Diterpenes with Inhibitory Effects on Increase in Vascular Permeability and Nitric Oxide Production from Hedychium coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry,10, pp. 2527–2534.

23. Morikawa T, Matsuda H, Sakamoto Y, Ueda K, Yoshikawa M., (2002) ―New Farnesane-Type Sesquiterpenes, Hedychiols A and B 8,9-Diacetate, and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from the Rhizome of

Hedychium coronarium‖, Chem. Pharm. Bull,50(8), pp. 1045—1049