1. 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây Hedychium coronarium tại Việt Nam
3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên
3.2.1. Điều chế tinh dầu:
Tinh dầu là phần cất cuốn hơi nước từ nguyên liệu. Như trong phần tổng quan đã trình bày, tinh dầu của các loài thuộc chi Hedychium bao gồm chủ yếu các dẫn xuất
49
oxi của mono và sesquitecpen, do đó chúng có nhiệt độ sôi tương đối cao; hơn nữa chúng phân bố trong thân rễ của loài này dưới dạng liên kết với các cơ chất là cellulose và tinh bột, không phải dưới dạng túi tinh dầu như một số nguyên liệu khác. Chính vì vậy, với phương pháp cất cuốn hơi nước thông thường không thể cho phép thu tinh dầu của củ các loài thuộc chi này cho hiệu suất cao.
Chúng tôi tiến hành cất cuốn hơi nước tinh dầu trong thân rễ ngải tiên trong một thiết bị đặc biệt (xem phần thực nghiệm trang 40). Thiết bị này cho phép đun hồi lưu bột củ tươi của cây ngải tiên với nước muối 10% để phá vỡ liên kết của tinh dầu với cơ chất và nâng nhiệt độ bình cất trên 1100C, do đó cất được cả thành phần sôi thấp và thành phần sôi cao. Có bộ phận bẫy tinh dầu bằng dung môi trong quá trình đun hồi lưu để thu gom tinh dầu, tránh được sự biến chất vì nhiệt của những cấu tử mẫn cảm với nhiệt trong tinh dầu. Với các ưu điểm này của thiết bị chúng tôi thu được tinh dầu củ cây ngải tiên với hiệu suất khá cao (0,12%) và chất lượng tốt, màu vàng chanh, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn. Trong khi đó Nguyễn Thị Thủy và cộng sự thu được tinh dầu củ cây ngải tiên trồng ở Từ Liêm chỉ được 0,09%[5].
3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên:
Đối với chất lỏng dễ bay hơi và nhiệt độ sôi thấp như tinh dầu thì phương pháp hiện đại nhất để phân tích và nhận biết các thành phần là phương pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ. Theo phương pháp này, chạy theo chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 900C, gia nhiệt 50C /phút đến 2800C trên máy GC-6890 MS-5973, chúng tôi xác định trong tinh dầu củ ngải tiên tươi có 27 thành phần (xem phụ lục số 1, trang 73),
chúng tôi đã nhận dạng được 11 thành phần là những thành phần có độ trùng lặp về phổ khối trên 90% so với phổ khối các chất trong thư viện máy (xem bảng 3.1).
50
Bảng 3.1: Các thành phần chính của Tinh dầu củ Ngải tiên vùng Sapa STT Thời
gian lƣu Tên chất
Hàm lƣợng (%) Độ trùng lặp(%) 1 6.62 β-pinen 0.55 97 2 8.12 1,8- cineole 2.23 99 3 10.29 Linalool 23.44 90 4 12.42 Borneol 1.33 91 5 12.79 Terpinen-4-ol 2.12 94 6 13.26 α-Terpineol 12.14 91 7 24.26 12-nor-caryophyll-5-en- 2-on 0.83 93 8 25.01 Nerolidol 11.86 91 9 26.64 Eudesmol 1.76 99 10 27.51 β-eudesmol 1.28 97 11 27.57 Valerianol 1.92 91 Cộng 59,44
Kết quả trên cho thấy số thành phần xác định được mới chiếm 59,44%; còn 40,56% trong tinh dầu chưa xác định được thành phần. Đây là một điều thú vị đối với tinh dầu ngải tiên, cần được nghiên cứu tiếp tục vì nó chiếm trên 1/3 lượng tinh dầu.
Khi so sánh thành phần chính của tinh dầu thân rễ cây ngải tiên này với thành phần chính của tinh dầu ngải tiên trồng tại Từ Liêm mà Nguyễn Thị Thủy và cộng sự đã công bố [5], chúng tôi thấy có sự khác biệt khá lớn vì thành phần và hàm lượng các thành phần. Điều này được thể hiện trên bảng 3.2.
51
Bảng 3.2: So sánh một số thành phần của tinh dầu củ ngải tiên Sapa và Từ Liêm
Thành phần Loại (%) Tinh dầu Linalool α- Terpineol terpinen- 4-ol Nerollidol và β- pinen 1,8-cineole Tinh dầu ngải
tiên SaPa 23,44 12,14 2,12 11,86 0,55 2,23 Tinh dầu ngải
tiên Từ Liêm - - - - 35,77 43,32
Sự khác biệt này có thể do phương pháp điều chế, cũng có thể do thổ nhưỡng và khí hậu, mùa lấy mẫu.
3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong củ cây Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig). (Hedychium coronarium Koenig).
3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong củ ngải tiên.
Như trong phần tổng quan cũng như mục tiêu của đề tài đã trình bày, loại hợp chất mà chúng tôi quan tâm nhất trong củ cây ngải tiên là các các - lacton diterpen , không no có khung của vòng labdan – điterpen. Chúng là những hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh, chống oxi hóa và chống viêm. Chúng là những chất có độ phân cực trung bình và vì vậy chúng tôi chiết chọn lọc chúng trong dung môi có độ phân cực trung bình Etyl axetat theo qui trình chiết trên sơ đồ 3.1
52 Ng©m víi etanol 96% ba lÇn, mçi lÇn 3 ngµy DÞch chiÕt etanol dÞch etanol + n-íc DÞch chiÕt n - hexan Làm kh« b»ng Na2SO4 DÞch chiÕt EtOAc CÆn hexan (H)
2gam, hiÖu suÊt 0,05%
CÆn EtOAc (CÆn E) 11gam, hiÖu suÊt 0,275%
4000 g bét cñ t-¬i Ng¶i tiªn
1. C« quay cßn 1/6 V
2. Pha thªm 4/6 V n-íc muèi b·o hßa 3. ChiÕt b»ng n - hexan 3 lÇn mçi lÇn 150 ml
DÞch Etanol + n-íc
ChiÕt 3 lÇn b»ng EtOAc mçi lÇn 100 ml
cÊt lo¹i dung m«i Làm kh« b»ng Na2SO4
cÊt lo¹i dung m«i
Sơ đồ 3.1: Qui trình chiết các hoạt chất sinh học trong bột củ ngải tiên
Kết quả trên cho thấy trong củ cây Ngải tiên hàm lượng các chất không phân cực hay kém phân cực rất thấp, 0,05% tính theo nguyên liệu tươi; trong khi đó hàm lượng các chất có độ phân cực trung bình rất cao: 0,275% tính theo nguyên liệu mẫu tươi. Đây cũng là điều mong ước của chúng tôi.
3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu và cặn chiết của củ ngải tiên của củ ngải tiên
Kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh đang là vấn đề của y dược học hiện đại. Vì sự tồn vong của mình, vi khuẩn luôn luôn biến đổi để kháng thuốc, thích nghi với kháng sinh. Và cũng vì sự tồn vong của mình, con người luôn luôn tìm kiếm thuốc mới để chống lại vi khuẩn gây bệnh để bảo vệ mình. Vì vậy cuộc chiến giữa con người và vi khuẩn là cuộc chiến khốc liệt, lâu dài và không có hồi kết. Để nhanh chóng đạt kết
53
quả trong việc nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn trong củ ngải tiên, con đường tốt nhất là theo phép thử sinh học (bioassay guided test) đối với tinh dầu và các cặn chiết chọn lọc H và E thu được từ củ cây này.
Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu tinh dầu và các cặn chiết H,E từ thân rễ ngải tiên đối với 8 loại vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) thuộc 4 nhóm khác nhau: Gram (+), Gram (-), nấm mốc, nấm men theo phương pháp thử hiện đại Vanden Bergher và Vliethin Gah. Kết quả thử được chỉ ra trên bảng 3.3.
Bảng 3.3 : Hoạt tính kháng VSVKĐ của các sản phẩm của củ ngải tiên VSV-
KĐ Mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:g/ml)
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
E. coli P. aruginosa B. subtillis S. aureus Asp. niger F. oxysporum C. albicans S. cerevisiae Tinh dầu 200 ( - ) ( - ) ( - ) 100 100 ( - ) ( - ) Cặn H ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 200 ( - ) ( - ) Cặn E ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) 200 ( - ) ( - )
Dấu (-) : không có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
Kết quả trên cho thấy hoạt tính kháng VSVKĐ trong củ ngải tiên tương đối kém, chỉ cho tác dụng đáng kể đối với nấm mốc F. Oxysporum với cường độ không mạnh. Do đó chúng tôi quan tâm các loại hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống oxi hóa, chống viêm trong củ cây ngải tiên.
3.3.3. Phân lập các hợp chất trong cặn chiết H và E của thân rễ ngải tiên. 3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và E bằng SKLM. 3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và E bằng SKLM.
Vì hoạt tính chống ung thư mạnh, chống oxi hóa và chống viêm của các hợp chất - lacton , không no thuộc dãy labdan – điterpen mà chúng tôi đặc biệt quan tâm và tìm kiếm mà thân rễ cây ngải tiên là nguồn nguyên liệu giàu loại hợp chất này. Trong
54
phần 3.3.1.chúng tôi đã nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc các hợp chất này trong thân rễ tươi của cây ngải tiên. Để phát hiện các hợp chất này trong cặn chiết, chúng tôi dùng SKLM với thuốc hiện FeCl3 1M (pH = 4) khi hơ nóng. Vì khi hơ nóng trong môi trường axit, các - lacton dễ bị thủy phân thành các - hydroxi axit tương ứng, nên chúng tạo với FeCl3 thành hợp chất màu xanh đen đặc trưng. Hơn nữa phương pháp SKLM còn cho phép chọn được hệ dung môi thích hợp cho việc phân lập các chất có trong cặn chiết và đánh giá độ phức tạp cũng như sơ bộ nhận dạng các hợp chất trong cặn chiết bằng thuốc thử đặc trưng.
Theo cách này, chúng tôi tiến hành khảo sát cặn chiết H bằng SKLM với hệ dung môi n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v; cặn E với hệ dung môi n – hexan/EtOAc, 7/3,v/v và hai thuốc hiện vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH = 4). Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.4 và 3.5.
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát cặn H bằng SKLM TT Rf Vanilin/H2SO4 FeCl3 1M
Nguội Nóng Nguội Nóng
1 0,07 Nâu Nâu sẫm Không màu Không màu
2 0,27 Xanh sẫm Đen Không màu Không màu
3 0,33 Xanh sẫm Đen Không màu Không màu
4 0,37 Xanh sẫm Đen Không màu Không màu
5 0,50 Nâu nhạt Hồng tím Không màu Xanh đen
6 0,62 Hồng Vàng Không màu Không màu
7 0,70 Hồng Tím Không màu Không màu
55
Bảng 3.5.Kết quả khảo sát cặn E bằng SKLM
TT Rf Vanilin/H2SO4 FeCl3
Nguội Nóng Nguội Nóng
1 0,15 Hồng Hồng đậm Không màu Không màu
2 0,42 Tím Tím hồng Không màu Xanh đen
3 0,56 Nâu Xanh mờ Không màu Không màu
4 0,75 Không màu Xám Không màu Xanh đen
5 0,85 Hồng Hồng tím Không màu Xanh đen
Kết quả trên cho thấy cặn chiết H rất phức tạp, có trên 8 thành phần nhưng chỉ có 1 thành phần là lacton dạng este có Rf = 0,5 và hiện màu hồng tím với vanillin và xanh đen với FeCl3 1M (pH =4) khi nóng. Còn cặn E thì ít phức tạp hơn, chỉ có 5 thành phần nhưng đáng chú ý là có tới 3 thành phần hiện màu xanh đen với FeCl3 khi đun nóng, không màu khi ở nguội, các thành phần này có thể là lacton hoặc este.
Kết quả này cũng cho thấy qui trình chiết rất chọn lọc vì không những cho hiệu suất cặn chiết E cao mà hợp chất lacton mà chúng tôi mong đợi tập trung trong cặn này.
3.3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết E và H
Đối với hợp chất có nhiệt độ sôi cao, phương pháp phân lập tốt nhất là phương pháp sắc kí cột. Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỉ lệ các chất cần phân tách trên chất hấp phụ, hoạt tính của các chất hấp phụ, kích thước cột, phương pháp rửa cột và dung môi rửa cột… Chúng tôi phân lập các chất lacton trong cặn E chiết từ thân rễ cây ngải tiên, kích thước cột 2,5 x 70 cm và dung môi rửa cột là n- hexan/EtOAc 7/3, v/v, tốc độ rửa 2 ml/phút. Kiểm tra và thu gom sản phẩm bằng SKLM. Kết quả chúng tôi phân lập được 4 chất sạch kí hiệu P5, P6, P7, P8 và P9. Chu trình phân lập được thể hiện trên sơ đồ 3.2.
56
Sơ đồ 3.2. Các phân đoạn phân lập các chất tinh khiết trong cặn E bằng sắc kí cột.
CÆn E; 2g 22-25 31 -40 44-55 67-87 82 - 88 128 - 160 P6, 120mg Rf = 0,7 P7, 150 mgRf = 0,65 P8, 50mgR f = 0,45 P5, 300 mg Rf = 0,79 1 -37 38-81 89 - 127 161-189 P9, 75 mg Rf = 0,25
Tương tự như trên nhưng với dung môi rửa cột là n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v từ cặn chiết H chúng tôi phân lập được một chất H6, có Rf = 0,5 hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) khi hơ nóng.
Như vậy chúng tôi đã phân lập được 6 chất tinh khiết từ các cặn chiết từ thân rễ cây ngải tiên.
3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được. 3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7 3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất P7
Hợp chất P7 là tinh thể hình kim, màu trắng, điểm nóng chảy 124oC và Rf= 0,65 ( n- hexan/EtOAc, 7/3,v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH = 4) khi đun nóng. Phổ IR của P7 (xem phụ lục số 4 trang 76 ) cho thấy có vòng - lacton , không no (C=O 1751 cm-1, và liên kết đôi 3 nhóm thế có C=C 1643 cm-1, C-H =829 cm-1); có liên kết đôi 2 nhóm thế dạng E ( exo – metylen) với C=C 1603 cm-1, C-H 900 cm-1.
57
Trên phổ 13 C – NMR và DEPT ( xem phụ lục số 7,8 trang 79,80) cho thấy rõ phân tử P7 có 20 nguyên tử C, trong đó có 3 nhóm metin olefin vùng trường yếu 120 – 145 ppm, 2 nhóm metin của Cacbon bậc 3 no vùng 55 – 65 ppm, 6 nhóm metylen và đặc biệt nhóm exo metylen có C = 108,40 ppm.
Khối phổ của P7 cho pic M+
= 300,6 (xem phụ lục số 5 trang 77). Từ các số liệu trên suy ra công thức phân tử của P7 là C20H28O2 và độ bội liên kết là 7. Vì phân tử hợp chất P7 có 20 nguyên tử cacbon, có vòng - lacton , không no, nhóm exo – metylen vì 3 nhóm metyl ở vùng trường mạnh nên có thể suy ra đây là diterpen và dựa vào qui luật đầu đuôi và đặc điểm các phổ chúng tôi xây dựng khung labdan. Những dữ kiện trên cho phép khẳng định P7 là Villosin có công thức như hình 3.1. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR được chỉ ra trong bảng 3.6. Số liệu phổ cũng như điểm chảy của P7 tương ứng với số liệu phổ và điểm chảy của villosin công bố trong tài liệu 25.
58 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1 H và 13C-NMR của hợp chất P7 Vị trí C C (ppm) của P7 C (ppm) của villosin [25] H (ppm) của P7 Độ bội, J(Hz) của P7 H (ppm) của villosin [25] 1 40,83 40,9 1,00; 1,40 m 1,00; 1,45 2 19,11 19,1 1,49; 1,46 m 1,40; 1,51 3 42,30 42,3 1,51; 1,21 m 1,18; 1,40 4 33,57 33,6 5 54,75 54,8 1,09 dd(2,68; 2,68) 1,09 6 23,38 23,4 1,71; 1,38 m 1,71; 1,39 7 36,75 36,8 2,45; 2,08 m 2,08; 2,44 8 149,40 149,4 9 62,22 62,2 2,37 m 2,37 10 39,29 39,3 11 136,87 136,9 6,89 dd(10,13; 10,13) 6,90 12 120,66 120,7 6,10 d (15,84) 6,11 13 129,55 129,6 14 142,34 142,3 7,14 br_s 7,15 15 69,56 69,6 4,8 d(1,6) 4,80; 16 172,31 172,3 17 108,40 108,4 4,5; 4,76 d(1,7); d(1,7) 4,51; 4,76 18 33,38 33,6 0,89 s 0,89 19 21,93 22,0 0,84 s 0,84 20 15,05 15,1 0,87 s 0,87
3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất P5
Hợp chất P5 là chất rắn vô định hình, không màu. Phổ IR (xem phụ lục 11 trang 83) cho thấy nhóm - OH (OH 3636 cm-1), vòng - lacton (C=O 1758 cm-1), nhóm exo -
59
metylen (3088, 1674 và 948 cm-1) và liên kết đôi 3 nhóm thế (1674, 948 cm-1). Phổ
13
C-NMR (xem phụ lục 14 trang 86)cho thấy có 20 nguyên tử cacbon trong phân tử, trong đó có nhóm cacbonyl (170,50 ppm), 4 cacbon olefinic (148,25, 143,48, 124,44 và 108,07 ppm), 3 nhóm metin, 8 nhóm metylen và 3 nhóm metyl. MS cho pic phân tử lượng 318(xem phụ lục 12 trang 84). Các số liệu trên cho phép xác định công thức phân tử P5 là C20H30O3. Phổ 1H-NMR một lần nữa khẳng định có nhóm vinyliden trong phân tử P5 thể hiện ở 2 proton geminal ở 4,83 ppm (1H, d, J 18.1) và 4,37 (1H, d, J 18.2). (xem phụ lục 13 trang 85) Kết luận này dựa trên sự tương tác của các proton lên cacbon có C =108,07 ppm qua phổ HSQC (xem phụ lục 16 trang 88). Phổ 1H&
13
C-NMR cho thấy có một liên kết đôi 3 nhóm thế thể hiện H = 6,72 ppm (1H,br_s) và
C = 143,48 ppm. Từ các số liệu trên chúng ta có công thức cấu tạo của P5 (hình 3.2) và các số liệu 1H và 13C-NMR trong bảng 3.7
60 Bảng 3.7: Số liệu 1 H&13C-NMR của hợp chất P5 Vị trí C C (ppm) của P5 C (ppm) của coronarin D [11] H (ppm) của P5 Độ bội, J(Hz) của P5 H (ppm) của coronarin D [11] 1 39,46 39,12 1,55; 1,15 m 2 19,25 19,21 1,49; 1,55 m 3 41,93 41,90 1,50; 1,2 m 4 33,61 33,57 5 55,25 55,21 1,16 dd(2,36; 2,36) 1,13 6 24,62 24,42 1,32 m 7 37,72 37,68 1,73 m 8 148,25 148,01 9 56,07 56,02 3,01 1H 2,99