III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1. Xác định tình trạng nhiễm giun lươn, giun đũa chó mèo và giun móc của thai phụ:
huyện Củ Chi. Số thai phụ đến khám tại Trung Tâm Y Tế và bệnh viện huyện Củ Chi tương đương. Như vậy, hàng năm mỗi cơ sở nhận khoảng 1403 thai phụ.
§ Số thai phụ không sinh tại hai cơ sở y tế trên rất it
§ Để có được 400 thai phụ đến sinh tại Trung Tâm Y Tế Củ Chi cần thời gian khoảng 4 tháng
§ Tiêm chủng BCG được thực hiện khi trẻ được 1 ngày tuổi
§ Thử nghiệm tuberculine và lấy máu tìm kháng thể thực hiện lúc trẻ được 6 tháng tuổi
§ Như vậy, 12 tháng là thời gian cần thiết để thực hiện các thử nghiệm trên lâm sàng
§ Cùng lúc đó, các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, phân tích số liệu và viết sơ lược báo cáo cũng được thực hiện
§ 6 tháng sau cùng, viết báo cáo chính thức, chuẩn bị nghiệm thu
III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1. Xác định tình trạng nhiễm giun lươn, giun đũa chó mèo và giun móc của thai phụ: thai phụ:
1.1. Xác định tình trạng nhiễm giun lươn và giun đũa chó mèo của thai phụ lúc 9 tháng của thai kỳ (tìm kháng thể kháng giun lươn và giun đũa phụ lúc 9 tháng của thai kỳ (tìm kháng thể kháng giun lươn và giun đũa
chó mèo):
v Kỹ thuật lấy mẫu máu, bảo quản và vận chuyển mẫu: lấy mẫu máu thai phụ lúc 9 tháng của thai kỳ: hút vô trùng 5ml máu tĩnh mạch cho vào 3 ống nghiệm:
§ Ống 1 có chất chống đông: 2ml để đếm tế bào máu
§ Oáng 2 không có chất chống đông: 2ml để định lượng đường, đạm trong máu
§ Ống 3 không có chất chống đông: 1ml để tìm kháng thể kháng ký sinh trùng
v Vận chuyển mẫu máu: mẫu lấy xong phải bảo quản vô trùng ở điều kiện nhiệt độ 20-26oC và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong thời gian tối đa 4 giờ.
v Kỹ thuật tìm kháng thể kháng ký sinh trùng:ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định hiệu giá kháng thể kháng giun lươn (Strongyloides stercoralis)
và giun đũa chó mèo (Toxocara canis) (16, 31, 36).
v Nguyên tắc: dùng kháng kháng thể được đánh dấu để phát hiện kháng thể có trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Chất đánh dấu trong phản ứng ELISA là một loại enzyme sẽ phản ứng với cơ chất và phát sinh màu. Kết quả được đọc bằng máy quang phổ kế.
Kháng nguyên - Kháng thể / mẫu – Kháng kháng thể gắn men – Cơ chất – phát hiện màu (Ủ 37oC/80 phút)
v Vật liệu:
- Huyết thanh chứng dương - Huyết thanh chứng âm
- Cộng hợp IgG thỏ kháng IgG người gắn men peroxidase - Cơ chất TMB/ dung dịch đệm + Hydrogen peroxide (Biorad)
- Dung dịch rửa: PBS 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.4 - Dung dịch ngưng phản ứng: H2 SO4 1M
- Kháng nguyên ES điều chế từ ấu trùng giai đoạn 2 của Toxocara canis: hiệu giá kháng thể từ 1/400 trở lên được xem là dương tính
o Độ nhạy: 100%
o Giá trị tiên đoán dương: 83.33%
o Độ đặc hiệu: 97.5%
o Giá trị tiên đoán âm: 100%
- Kháng nguyên điều chế từ ấu trùng giun lươn Strongyloides strecoralis. Hiệu giá kháng thể từ 1/400 trở lên được xem là dương tính.
o Độ nhạy: 93.33%
o Giá trị tiên đoán dương: 100%
o Độ đặc hiệu: 100%
o Giá trị tiên đoán âm: 99.33%
(Các kháng nguyên do nhóm nghiên cứu điều chế theo qui trình của Viện Quốc Gia Y Tế Công Cộng và Bảo Vệ Môi Trường Hà Lan – Viện RIVM – Bilthoven. Đông khô, bảo quản ở 4oC.
Giấy chứng nhận số: 4680/KQNC ngày 29/10/2003 – Trung Tâm Thông Tin Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia – Bộ Khoa Học và Công Nghệ)
v Tiến hành:
- Giá nhựa 96 giếng được gắn kháng nguyên ký sinh trùng - Rửa 5 lần bằng dung dịch PBS 0.01M, pH 7.4
- Phủ 100µl huyết thanh chứng dương, huyết thanh chứng âm, huyết thanh bệnh nhân pha loãng 1/200
- Ủ 37oC trong 1 giờ
- Rửa 5 lần bằng dung dịch PBS 0.01M, pH 7.4
- Phủ cộng hợp (IgG thỏ kháng IgG người gắn peroxidase)
- Ủ 37oC trong 1 giờ
- Rửa 5 lần bằng dung dịch PBS 0.01M, pH 7.4
- Hiện màu bằng cơ chất TMB/ dung dịch đệm + Hydrogen peroxide - Để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 15 phút
- Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA
v Đọc kết quả: bằèng máy đọc ELISA:
- Gọi OD (optic density) là mật độ quang của mẫu thử
- COV (cut-off value) là giá trị ngưỡng (ngưỡng: OD trung bình cộng của 40 chứng âm + 3 độ lệch chuẩn)
- Kết quả được ghi nhận như sau:
∗ Dương tính (có nhiễm giun): OD/COV≥1
∗ Âm tính (không nhiễm giun): OD/COV≤0.8
∗ Nghi ngờ: OD=/COV=0.8-1, phải làm lại thử nghiệm (16, 31, 36)
1.2. Xác định nhiễm giun móctrong phân:
v Kỹ thuật lấy mẫu phân:
- Dùng dung dịch cố định phân F2AM gồm: formol, phenol, alcool và xanh methylen
- Lấy 1 thể tích phân cỡ bằng hạt đậu phộng khuấy đều trong 2ml dung dịch F2AM (16, 31, 36)
v Phương pháp tìm trứng giun trong phân:
Mẫu phân được xử lý khi đem về phòng xét nghiệm.
Phết phân chú ý tìm trứng giun móc và các ký sinh trùng khác.
- Vật liệu:
∗ Lamen
∗ Lam kính
∗ Viết chì sáp
∗ Que tre, gỗ hay vòng cấy - Kỹ thuật:
o Quan sát trực tiếp
∗ Ghi tên bệnh nhân, mã số trên lame
∗ Dùng que tre phết phân lên lam kính
∗ Đậy lamen lên phết vừa làm
∗ Giữ lamen ở một cạnh, cho cạnh kia tiếp xúc với phết phân vừa thực hiện và hạ nhẹ nhàng xuống tấm lam, tránh tạo bọt khí
∗ Quan sát dưới vật kính x10, nếu thấy trứng có thể quan sát bằng vật kính 40 (16, 31, 36)
∗ Kỹ thuật tập trung: kỹ thuật Willis dùng với nước muối bão hòa để làm nổi trứng ký sinh trùng (16, 31, 36)
Hình thể trứng giun móc:
∗ Trứng hình bầu dục có kích thước 60x40µm
∗ Vỏ mỏng, trong suốt
∗ Trứng có chứa phôi bào (16, 31, 36)