SẮC KÝ CỘT
Bảng 3.14. Thông số sắc ký cột để tinh chế dịch chiết Q-10 từ phƣơng pháp (III) và phƣơng pháp (IV)
Thông số Cột I Cột II
Chất sắc ký (g) 4,3 g (4,5 g) cắn 1,05 g (1,15 g) cắn thu từ cột sắc ký 1 Chất hấp phụ Silicagel 60 F254 (0,063 – 0,2 mm) (Merk) Quy cách cột (cm x cm) 3,0 x50 1,5 x 40
Chiều cao cột silicagel 35 30
Dung môi ly trích (tỉ lệ v:v)
CHCl3 n-hexan : etyl acetat (100:0, 96:4, 94:6,
92:8)
Tốc độ chảy (giọt/phút) 30 5
Thể tích mội phân đoạn (ml) 10 5
Tổng số phân đoạn 50 50
Phân đoạn thu nhận 9 - 16 16 - 22
Từ 300g sinh khối tƣơi của vi khuẩn R. palustris thu đƣợc 168 mg (185 mg) bột màu vàng cam, là hợp chất Q-10. Sau khi kết tinh lại sản phẩm thu đƣợc 130mg (146 mg) tinh thể màu vàng cam vô định hình, không ánh kim.
65
Hình 3.15. Phân đoạn dịch chiết có chứa Q-10 từ sắc ký cột II (C, chuẩn; các chấm có đánh số tƣơng ứng với các phân đoạn thu nhận trên sắc ký cột II)
Hình 3.16. Bột kết tinh Q-10
a Vạch Q-10
66
Hình 3.17. Hình dạng tinh thể Q-10 dƣới kính hiển vi
Chủng PN21 có hàm lƣợng Q-10 cao nhất nên chọn làm chủng thí nghiệm để nhân sinh khối và chiết xuất Q-10. Việc chiết xuất Q-10 từ sinh khối vi khuẩn đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp III và phƣơng pháp IV.
Cắn thu đƣợc sau khi cô quay dịch chiết đƣợc hòa tan trong cloroform và đƣa mẫu vào cột silicagel. Quy trình sắc ký đƣợc thực hiện qua hai giai đoạn là sắc ký cột thô (nhanh) và sắc ký tinh (chậm). Các thông số kỹ thuật của các giai đoạn sắc ký đƣợc trình bày ở Bảng 3.14 . Phân đoạn của cột I có sự hiện diện của Q-10 đƣợc cô thành cắn và cho lên cột 2. Tất cả các phân đoạn đều đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng song song với dịch chiết Q-10 chuẩn. Các phân đoạn chứa hợp chất Q-10 đƣợc thu nhận và cô thành cắn hoặc cho bay hơi tự nhiên.
Ở sắc ký cột thứ nhất, phân đọan cần thu nhận là những phân đoạn có chứa chủ yếu hợp chất Q-10 đƣợc xác định bằng quá trình sắc ký. Trên sắc ký đồ nhận thấy chỉ các phân đoạn từ 9- 16 có RF tƣơng đƣơng với Q-10 chuẩn. Các phân đoạn khác đều không có, chứng tỏ rằng hợp chất Q-10 đã đƣợc thôi ra trong các phân đoạn kể trên.
Các phân đoạn thu nhận đƣợc ở cột thô đƣợc cô thành cắn và hòa tan lại trong n- hexan cho lên cột thứ hai. Kiểm tra các phân đoạn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và tiến hành đo quang song song ở bƣớc sóng 275nm. Xác định đƣợc phân đoạn từ
67
16 – 23 cho một vệt duy nhất trên sắc ký lớp mỏng và OD275 của các phân đoạn có Q-10 tăng dần, đạt cao nhất rồi giảm xuống. Thu nhận các phân đoạn có chứa duy nhất Q-10, làm bay hơi dung môi và thu nhận cắn.