Kết quả cuối cùng của quá trình chiết xuất, tinh chế là phải thu đƣợc tinh thể Q-10 nguyên chất. Các bƣớc của quá trình tinh chế và kết tinh bao gồm việc chọn dung môi để loại tối đa tạp chất, loại bỏ chất màu, hoà tan nóng và lọc, kết tinh ở điều kiện lạnh, gạn tinh thể và làm khô tinh thể.
2.3.6.1. Tinh sạch Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký cột
Dịch chiết Q-10 từ vi khuẩn sau khi tiến hành chiết tách sẽ đƣợc phân tách và tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký cột. Cột sắc ký bằng thủy tinh, trƣớc khi sử dụng đƣợc rửa sạch và sấy thật khô. Cột khô đƣợc lắp thẳng đứng trên một giá cố định, đáy cột đƣợc lót một lớp bông gòn mỏng. Chất nhồi là Silicagel 60 F254 với cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm (Merk) đƣợc cho vào cột bằng kỹ thuật nhồi ƣớt (cho vào cùng dung môi chạy sắc ký), lắc và trộn đều silicagel với dung môi và đổ vào cột. Mở khóa cho dung môi chảy xuống và silicagel lắng đều vào cột. Ổn định cột bằng hệ dung môi chạy sắc ký trong 3-5 giờ trƣớc khi nạp mẫu vào.
Việc phân tách và tinh sạch Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký cột đƣợc thực hiện qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn sắc ký cột nhanh: để chọn phân đọan có chứa chủ yếu hợp chất Q- 10. Ở đây sử dụng cột sắc ký có kích thƣớc 3 x 30cm. Lƣợng chất thử đƣa vào đƣợc tính bằng g. Dung ly chất thử trong cột bằng dung môi cloroform với tốc độ 20 giọt/phút, thể tích mỗi phân đọan là 10ml. Phân đoạn có chứa Q-10 đƣợc chọn lọc bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n- hexan: acetate etyl (4v : 1v).
Giai đọan sắc ký cột chậm: để thu nhận Q-10 tinh sạch. Sử dụng cột sắc ký có kích thƣớc 1 x 10cm. Phân đoạn chứa Q-10 thu đƣợc từ cột I đƣợc bay hơi dung môi và cho vào cột II. Sắc ký ở cột này với hệ dung môi là n-hexan: acetate etyl có tính phân cực tăng dần với tỷ lệ (100 : 0), (98 : 2), (96: 4), với tốc độ 10 giọt/phút và thể tích mỗi phân đoạn là 5ml. Chọn lọc các phân
38
đọan chỉ chứa một vết Q-10 thông qua sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi
n-hexan: acetate etyl (4 : 1). Dịch chứa Q-10 tinh sạch cô đặc, kết tinh và định lƣợng.
Hình 2.5. Tóm tắt quá trình tinh sạch Q-10 từ phƣơng pháp sắc ký cột
2.3.6.2. Phƣơng pháp kết tinh Q-10
Kết quả cuối cùng của quá trình tinh chế là phải thu nhận đƣợc Q-10 dƣới dạng tinh thể nguyên chất. Các bƣớc của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi thích hợp, hòa tan nóng, để lạnh kết tinh, lọc thu tinh thể và làm khô tinh thể trong điều kiện thích hợp.
Cho bột Q-10 vào một cốc có mỏ 100 ml cho một lƣợng nhỏ ethyl acetate vừa đủ để hòa tan Q-10. Nhỏ methanol đã đƣợc làm lạnh vào cho đến khi dung dịch trở nên đục, sau đó cho cốc vào tủ lạnh để tinh thể kết tinh. Lọc lấy tinh thể và làm khô. Tinh thể này đƣợc phân tích lý hóa tiếp theo.
Sinh khối VK
Chiết xuất
Cắn
Hòa tan trong cloroform hoặc n-hexan
Sắc ký cột
39
Xác định độ tinh khiết của sản phẩm:
Sản phẩm Q-10 tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ. Thông số kỹ thuật tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.3.5.3.
Đo phổ hồng ngoại của sản phẩm Q-10
Phổ hồng ngoại (infrared spectrometry, IR) của một hợp chất hữu cơ là phổ hấp thụ của hai dạng năng lƣợng: năng lƣợng dao động và năng lƣợng quay khi hợp chất hữu cơ đó hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 1-100 m và biến thành năng lƣợng dao động của phân tử. Sự hấp thụ ấy trong phổ hồng ngoại đƣợc biểu thị thành các dải hấp phụ với cƣờng độ khác nhau bởi vì sự biến đổi năng lƣợng dao động luôn luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng quay. Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, vào hằng số lực các dây nối và vào cấu trúc hình học của nguyên tử. Do vậy, có thể ứng dụng phổ hồng ngoại để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ dựa vào sự hấp thụ trong vùng 2,5 – 1,5 m.
Cân 1,5mg Q-10 nghiền với bột KBr. Chuyển hỗn hợp lên giá mang của khuôn ép và đặt lên cối thủy lực để tiến hành ép mẫu thành một lớp mỏng trên giá mang có chứa mẫu đo phổ hồng ngoại. Đƣa mẫu vào trong cốc đo và tiến hành theo chƣơng trình cài sẵn trên máy. Ghi nhận kết quả và đối chiếu với lý thuyết.
40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP
CHO VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU
HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS