PHỔ
Sử dụng máy quang phổ quét để dò tìm các cực đại hấp thu của Q-10 trong dung dịch Q-10 chuẩn và trong các dung dịch Q-10 cô lập từ dịch chiết vi khuẩn.
Hình 3.8.Phổ hấp thu tử ngoại của dung dịch Q-10 chuẩn
Hình 3.8 cho thấy hợp chất Q-10 chuẩn có hai đỉnh hấp thu cực đại nằm trong vùng quang phổ tử ngoại gần tại các độ dài sóng: 1 = 215,4 (nm) và 2 = 275,2 (nm).
200 250 300 nm a1 0.0 0.5 1.0 1.5 Abs
52
Bảng 3.5. Quang phổ hấp thu cực đại mẫu Q-10 chuẩn
Q-10 chuẩn Bƣớc sóng hấp thu cực đại Đỉnh hấp thu 1 ( 1, nm) Đỉnh hấp thu 2 ( 2, nm) 215,5 274,7 215,4 275,2 215,3 275,6 Trung bình 215,4 275,2
Khi một phân tử hấp thu năng lƣợng của bức xạ điện từ, phân tử ấy có thể trải qua nhiều dạng kích thích (dịch chuyển điện tử, quay, làm biến dạng dây nối liên kết hoặc ion hóa) Mỗi dạng kích thích đều cần đến một năng lƣợng nhất định và sự hấp thu tƣơng ứng với mỗi mức năng lƣợng sẽ xảy ra ở một vùng khác nhau trên phổ điện từ. Sự hấp thụ trong vùng phổ tử ngoại và khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử và mỗi nhóm cấu trúc điện tử xác định sẽ có một phổ hấp thu đặc trƣng của nó hấp thu. Với hai nhóm dion gắn ở mạch vòng, Q-10 có cấu trúc điện tử hấp thụ trong vùng tử ngoại gần (200 – 380 nm). Chính vì vậy, sử dụng máy quang phổ quét để dò tìm các cựa đại hấp thụ của Q-10 trong dung dịch Q-10 chuẩn và các dung dịch Q-10 cô lập từ dịch chiết vi khuẩn.
Trong dung môi n-hexan, Q-10 chuẩn hấp thu quang phổ tử ngoại cực đại tại các độ dài sóng 1 = 215,4 (nm) và 2 = 275,2 (nm). Kết quả ở Bảng 3.6cho thấy Q-10 cô lập từ dịch chiết vi khuẩn trong dung môi n-hexan cũng có hai đỉnh hấp thu cực đại:
1 = 213,6 - 216 (nm) và 2 = 274 – 276,3 (nm). So sánh các đỉnh hấp thu cực đại của các mẫu dung dịch Q-10 cô lập từ dịch chiết vi khuẩn với các đỉnh hấp thu cực đại của dung dịch Q-10 chuẩn, nhận thấy rằng các hợp chất đƣợc cô lập này đều có hai đỉnh hấp thu trong vùng tử ngoại tƣơng tự với Q-10 chuẩn. Mức độ chênh lệch trung bình về bƣớc sóng hấp thu của các hợp chất này với hợp chất Q-10 chuẩn là 0,6 – 1,8 nm tại đỉnh hấp thu 1 và 1,1 – 1,2 tại đỉnh hấp thu 2. Kết quả trên nằm trong mức độ sai số cho phép nên có thể khẳng định hợp chất thu nhận từ dịch chiết vi khuẩn đƣợc cô lập từ sắc ký lớp mỏng là Q-10.
53
Bảng 3.6. Quang phổ hấp thu cực đại của các mẫu Q-10 sau khi cô lập
Mẫu Q-10 Bƣớc sóng hấp thu cực đại Đỉnh hấp thu 1 ( 1, nm) Đỉnh hấp thu 2 ( 2, nm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB PN16 (I) 215,6 214,2 214 214,6 275,6 275,2 275,8 275,5 PN16 (II) 214,6 215,2 214,8 214,9 274,4 274,2 274,8 274,5 PN16 (III) PN16 (IV) 214,5 214,5 214 215,2 215,8 214,3 214,8 214,7 275 275 275,2 276,3 275,8 275,4 275 275,6 PN21(I) 214,2 213,7 214 214 274,8 274,4 274,2 274,8 PN21 (II) 214,6 214,8 215 214.8 275,8 275,6 275 275,8 PN21 (III) PN21(IV) 213,8 215 214,5 214,6 213,6 214,8 214 214,8 275,8 274,6 275,6 275,2 275,2 275,4 275,5 275,1 PN31 (I) 215 215,2 214,8 215 276,4 276 275,8 276,1 PN31 (II) 214,8 213,5 215,1 214,5 274,6 274,8 275,2 274,9 PN31(III) PN31 (IV) 213,6 216 214,6 214,3 214,7 215,3 214,3 215,2 275,8 274,6 275,6 274 276 275,3 275,8 274,6
3.2.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LUỢNG Q-10 TRONG CÁC CHỦNG VI
KHUẨN R. PALUSTRIS PN16 , PN21 VÀ PN31 BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ
3.2.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ dung dịch Q-10 tho mật độ quang ở bƣớc sóng 275nm
Để định lƣợng Q-10 thu nhận từ dịch chiết bằng phƣơng pháp quang phổ, chúng tôi tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ dung dịch Q-10 theo giá trị OD. Đo OD tại bƣớc sóng 275nm tƣơng đƣơng với đỉnh hấp thu của Q-10 chuẩn trong dung môi n-hexan. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3.7
54
Bảng 3.7. Nồng độ Q-10 chuẩn với giá trị OD275 tƣơng ứng
Xử lý số liệu bằng chƣơng trình MS-Excell đã xác định đƣợc đặc điểm mối tƣơng quan giữa các nồng độ dung dịch Q-10 chuẩn xác định với các giá trị OD275 tƣơng ứng nhƣ sau [4]:
Phƣơng trình hồi quy biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và hàm lƣợng có dạng:
yâ == 0.0171x + 0.0611
Với các hệ số hồi quy bo và b đều có ý nghĩa (p = 0,04 đối với giá trị b0 và p = 0,00 cho giá trị b).
Hệ số tƣơng quan: R2 = 0,996
Hình 3.9. Đƣờng chuẩn của nồng độ dung dịch Q-10 theo OD275
3.2.3.2. Đánh giá hiệu suất chiết của ba phƣơng pháp chiết khác nhau thông qua định lƣợng hàm lƣợng Q-10 trong dịch chiết Nồng độ Q-10 ( g/ml) 10 20 30 40 50 60 OD275 Lần 1 0,2213 0,3974 0,5915 0,7532 0,9268 1,0560 Lần 2 0,2259 0,3926 0,5930 0,7540 0,9270 1,0573 Lần 3 0,2243 0,3966 0,5912 0,7538 0,9269 1,0567 OD275 (nm) TB 0,2238 0,3955 0,5919 0,7536 0,9269 1,0567
55
Để chiết xuất Q-10 từ ba chủng vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh, chúng tôi đã chọn bốn phƣơng pháp chiết tách Q-10 trực tiếp với dung môi khác nhau: (I) Phƣơng pháp Collin & cộng sự; (II) Phƣơng pháp Paterson & cộng sự; (III) Phƣơng pháp Yoshida và cộng sự, (IV) Phƣơng pháp W. Zhong và cộng sự
Hiệu xuất chiết thông qua đánh giá hàm lƣợng Q-10. Kết quả định lƣợng hàm lƣợng Q-10 trong các dịch chiết đƣợc trình bày ở các bảng phía dƣới.
Bảng 3.8. Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN16 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp I Phƣơng pháp II Phƣơng pháp III Phƣơng pháp IV
Lần TN 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 SK (g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Cắn (mg) 30,2 30,5 31 29 28,5 29,1 28 28,5 27,6 29 28,5 28 HL Q10 ( g/ml) 46 46,5 47 50 51,7 52,5 53,5 52,4 54 54,5 54 54,6 HL Q10 ( g/g SKT) 345 348,8 352,5 375 387,8 393 401,3 393 405 408,7 405 409,5 348,8 385,3 399,8 407,7
Bảng 3.9. Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN21 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau
Phƣơng pháp I Phƣơng pháp II Phƣơng pháp III Phƣơng pháp IV
Lần TN 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 SK (g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Cắn (mg) 31,5 31,6 32 30 29,5 30,5 29,8 30,5 30 31 31,2 31,5 HL Q10 ( g/ml) 51 51,5 50,5 54 54,7 54,5 57,5 58,4 58 59 59,5 59,8 HL Q10 ( g/g SKT) 382 386,3 378,8 405 410,3 408,8 431,3 438 435 442,5 446,3 448,5 382,4 408 434,8 445,8
56
Bảng 3.10. Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN31 đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau
Phƣơng pháp I Phƣơng pháp II Phƣơng pháp III Phƣơng pháp IV
Lần TN 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 SK (g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Cắn (mg) 30 29 29,5 28 28,5 29,1 27 28,5 27,6 27 27,5 28 HL Q10 ( g/ml) 45 45,5 44,5 48 48,1 47 51 51,4 51 52,5 52 52,6 HL Q10 ( g/g SKT) 337,5 341,3 333,8 360 360,8 352,5 382,5 386,3 382,5 393,8 390 394,5 337,5 357,8 383,8 392,8
Hình 3.10. Đồ thị hàm lƣợng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R. palustris đƣợc chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau
Dựa vào tính chất lý hóa và sự phân bố nội bào của hợp chất Q-10 trong tế bào vi khuẩn nên phải sử dụng các dung môi chiết Q-10 phải là những dung môi có khả năng phá vỡ màng tế bào và hòa tan đƣợc tối đa Q-10 nhƣ aceton, chloroform, n- hexan … Việc chọn hệ dung môi cùng với quy trình phù hợp chiết đóng vai trò quyết định trong việc thu nhận hợp chất Q-10. Một hệ dung môi chiết xuất đƣợc
57
đánh giá là hiệu quả khi thời gian của quá trình chiết xuất ngắn và tỷ lệ lƣợng chất chiết so với hàm lƣợng cắn khô cao.
Trong đề tài, để chiết xuất Q-10 từ tế bào vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu hùynh khảo sát, đã tiến hành trên bốn phƣơng pháp chiết trực tiếp với các hệ dung môi khác nhau: (I) Phƣơng pháp Collin & cộng sự với hệ dung môi clorofrom : methanol (2v : 1v) có thời gian chiết 120 phút; (II) Phƣơng pháp Paterson & cộng sự với hệ dung môi n-hexan : methanol (3v : 2v) có thời gian chiết là 60 phút; (III) Phƣơng pháp Yoshida và cộng sự với hệ dung môi là n-hexan : n-propanol (6v :10v) có thời gian chiết khoảng 60 phút; (IV) phƣơng pháp của Weihong Zhong với dung môi n- hexan có thời gian chiết khoảng 90 phút.
Kết quả phân tích dữ liệu thống kê (Phân tích phƣơng sai hai yếu tố có lặp) cho thấy
hàm lƣợng Q-10 từ 4 phƣơng pháp chiết xuất, khác nhau có ý nghĩa ( với F = 54,9 > F0,05 = 4,066 ở chủng PN16; F = 294 > F0,05 = 4,066 ở chủng PN21
và F = 127,86 > F0,05 = 4,066 ở chủng PN31)
Thông qua việc xác định trực tiếp hàm lƣợng Q-10 bằng phƣơng pháp quang phổ trong cả ba phƣơng pháp chiết, nhận thấy chủng PN21 có hàm lƣợng Q-10 cao hơn hai chủng PN16 và PN31. Mức chênh lệch hàm lƣợng Q-10 giữa các chủng không quá lớn, điều này giải thích bởi hợp chất này là một sản phẩm sơ cấp trong quá trình chuyển hóa của tế bào sinh vật và chúng tham gia vào quá trình hình thành tế bào và chỉ đƣợc sản xuất lƣợng vừa đủ cho nhu cầu của tế bào.
Phƣơng pháp Collin & cộng sự trƣớc đây thƣờng đƣợc sử dụng cho việc chiết xuất Q-10 từ vi khuẩn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có thời gian chiết xuất lâu, lƣợng dung môi tiêu tốn nhiều và hiệu quả chiết lại là thấp hơn các phƣơng pháp còn lại. Trong khi đó phƣơng pháp của Paterson & cộng sự là phƣơng pháp đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng là nấm nhƣ Penicillium, phƣơng pháp này giảm đƣợc thời gian chiết khoảng ½ so với phƣơng pháp (I) và kết quả hàm lƣợng Q-10 cho cao hơn. Điều này có thể kết luận rằng hệ dung môi có khả năng phá vỡ màng tế bào tốt hơn và hòa tan đƣợc tối đa Q-10.
58
Phƣơng pháp của Yoshida và cộng sự đƣợc công bố vào năm 1998 với đối tƣợng áp dụng là các chủng Agrobacterium và Rhodobacter. Nhận thấy phƣơng pháp chiết xuất này rất phù hợp với các chủng vi khuẩn khảo sát, thời gian chiết ngắn hơn phƣơng pháp (I) và cho hàm lƣợng Q-10 là cao hơn phƣơng pháp (II).
Phƣơng pháp chiết Q10 của Weihong Zhong và cộng sự (2009) cho nồng độ Q10 là cao nhất và thời gian thực hiện khoảng 90 phút
Do vậy, phƣơng pháp (III) và (IV) đƣợc chọn để thu nhận Q-10 ở lƣợng lớn và so sánh hiệu quả chiết xuất cũng nhƣ độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế. Kết quả định lƣợng Q-10 bằng phƣơng pháp quang phổ cho thấy:
Chủng PN21 có hàm lƣợng Q-10 là cao nhất, tiếp đến là chủng PN16 và cuối cùng là chủng PN31. Từ đây có thể suy ra hàm lƣợng Q-10 trên 1kg sinh khối tƣơi chiết theo phƣơng pháp (III) của chủng PN16, PN21 và PN31 lần lƣợt là 395mg, 435 mg, 367mg. Theo nghiên cứu khác đƣợc thực hiện ở Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam), hàm lƣợng Q-10 trong hỗn hợp sinh khối vi khuẩn R. palustris và Rhodobacter sphaeroides là 200 – 300 mg/kg sinh khối tƣơi của vi khuẩn [5]. Nhƣ vậy các chủng vi khuẩn mà trong đề tài này khảo sát so với nghiên cứu trong nƣớc thì hàm lƣợng Q-10 cũng tƣơng đối cao. Trên thế giới các chủng vi khuẩn dùng để sản xuất thƣơng mại thì đa số đã đƣợc đột biến làm tăng khả năng sản xuất Q-10, khi đó hàm lƣợng của Q-10 có thể đạt đƣợc khoảng 1,5 mg/g sinh khối. [18]
3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA VITAMIN VÀ TIềN Tố Tự NHIÊN
LÊN SỰ TỔNG HỢP Q-10
59
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của vitamin lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31
Lô TN Vitamin bổ sung Hàm lƣợng Q-10 ( g/g SKT)
Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 Chứng 350 375 325
2 Viatmin A 338 345 281,6
3 Vitamin C 388,5 410,5 348
4 Vitamin E 395 435 367
Hình 3.11. Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-10 ở chủng PN16
60
Hình 3.12. Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-10 ở chủng PN21
Hình 3.13. Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-10 ở chủng PN31
61
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ vitamin E lên sự tổng hợp Q10
Lô TN Nồng độ Vit E ( g/ml) Hàm lƣợng Q-10 ( g/g SKT) Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 Chứng 348 383 337 2 1 350 385,6 340,2 3 2,5 368 397,5 358 4 5 397,8 432,4 354,2 5 7,5 390,6 427 340,7
Nồng độ Vitamin E là 5 g/ml cho sự tổng hợp CoQ10 là cao nhất.
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q10 Lô TN Tiền tố bổ sung Hàm lƣợng Q-10 ( g/g SKT)
Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 SA 355 380 335 2 SA + Cà chua 25% 350 379 336 3 SA + Cà chua 50% 373 400 351 4 SA + Cà chua 75% 365 385 342 5 SA + Cà rốt 25% 355 382 340 6 SA + Cà rốt 50% 392 435 350,5 7 SA + Cà rốt 75% 395 435,7 352,1
62
Hình 3.14. Đồ thị ảnh hƣởng của tiền tố tự nhiên lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-10 của các chủng R. palustris
Con đƣờng sản xuất carotenoid và CoQ10 có chung chất trung gian geranyl diphosphate, sau đó chất này đƣợc biến đổi trực tiếp thành carotenoid, trong khi đó để tạo CoQ10 cần sự góp mặt của 6 phân tử IPP. Vào năm 1881, Nagasaki và Natori đã phát hiện các tiền tố quan trọng của polyprenyl pyrophosphate có trong cà rốt và cà chua. [5]
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng SA có chứa nƣớc chiết cà rốt và cà chua, sau 72 giờ nuôi cấy thu sinh khối và tách CoQ10, kết quả cho thấy: hai loại nƣớc chiết trên có ảnh hƣởng tích cực đến hàm lƣợng CoQ10, ở nồng độ nƣớc chiết cà chua 50% làm nồng độ CoQ10 tăng khoảng 5%, nồng độ nƣớc chiết cà rốt 50-75% cho kết quả CoQ10 tăng 10-15%. Nhƣng với nồng độ nƣớc ép cà chua đậm đặc hơn thì vi khuẩn bắt đầu có dấu hiệu sinh trƣởng giảm lại.
Kết quả thí nghiệm phù hợp với công bố của Bule và Singhal (2009), đã báo cáo về các tiền tố tự nhiên có trong cà rốt và cà chua làm tăng 56-87% CoQ10 ở
Pseudomonas diminuta trên cùng đơn vị nuôi cấy so với môi trƣờng tối ƣu không bổ sung tiền tố. [14]
63
So sánh việc bổ sung tiền tố vào môi trƣờng và bổ sung vitamin E, nhận thấy việc bổ sung vitamin E vào môi trƣờng nuôi cấy cho kết quả gần nhƣ kết quả nuôi cấy trên dịch ép cà rốt.
Từ các khảo sát trên, chúng tôi đƣa ra một công thức môi trƣờng nuôi cấy phù hợp cho vi khuẩn quang dƣỡng tía khảo sát là:
Sodium acetate 1,0g Mannitol 1,0g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,6g (NH4)2SO4 1,0g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g CaCl2.2H2O 0,05g Na2S2O3. 5H2O 0,1g Thêm pepton 0,5g Cao nấm men 0,75g Vitamin E 5 mg Dung dịch vi lƣợng 1ml Nƣớc cất vừa đủ 1000ml Dung dịch vi lƣợng EDTA-2Na 1,0g FeCl3 2,0g ZnCl3 0,1g MnCl2 0,1g H3BO3 0,1g CoCl2 .6H2O 0,1g Na2MO4.2H2O 20mg CuCl2 10mg NiCl2.6H2O 10mg
64 Na2SeO3 5mg Thêm nƣớc cất vừa đủ 1000ml
3.4. KẾT QUẢ TINH CHẾ HỢP CHẤT Q-10
3.4.1. KẾT QUẢ TINH CHẾ HỢP CHẤT Q-10 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT SẮC KÝ CỘT
Bảng 3.14. Thông số sắc ký cột để tinh chế dịch chiết Q-10 từ phƣơng pháp (III) và phƣơng pháp (IV)
Thông số Cột I Cột II
Chất sắc ký (g) 4,3 g (4,5 g) cắn 1,05 g (1,15 g) cắn thu từ cột sắc ký 1 Chất hấp phụ Silicagel 60 F254 (0,063 – 0,2 mm) (Merk) Quy cách cột (cm x cm) 3,0 x50 1,5 x 40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiều cao cột silicagel 35 30
Dung môi ly trích (tỉ lệ v:v)
CHCl3 n-hexan : etyl acetat (100:0, 96:4, 94:6,
92:8)
Tốc độ chảy (giọt/phút) 30 5
Thể tích mội phân đoạn (ml) 10 5
Tổng số phân đoạn 50 50
Phân đoạn thu nhận 9 - 16 16 - 22
Từ 300g sinh khối tƣơi của vi khuẩn R. palustris thu đƣợc 168 mg (185 mg) bột màu vàng cam, là hợp chất Q-10. Sau khi kết tinh lại sản phẩm thu đƣợc 130mg