2.3.5.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography, TLC) là phƣơng pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chứa chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại tại những vị trí khác nhau.
Tiến hành sắc ký: Hòa mẫu vào trong một thể tích nhỏ n-hexan. Chấm 10µl mẫu Q-10 chuẩn và mẫu dịch chiết có chứa Q-10 lên bản TLC Merck 60 F254. Triển khai sắc ký trong n-hexan:etyl acetat (4 : 1) ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút hoặc trong hệ dung môi n-hexan:etyl ether (4 : 1) . Sau khi khai triển, sấy khô bản sắc ký
Cách thủy 90oC trong 30 phút/làm lạnh nhanh 2g Sinh khối tƣơi của
VK
0,35g acid pyrogallic + 1,25g KOH + 9,5ml methanol + 3,5ml dH2O
Cho vào becher chứa 40ml hexan
Cô quay
Hòa tan trong n-hehexane
Phân tích
36
rồi quan sát dƣới đèn UV 254nm: mẫu Q-10 cho vết tròn sậm màu trên nền hùynh quang xanh da trời [2] [15].
2.3.5.2. Định tính bằng phƣơng pháp quang phổ
Phổ hấp phụ của p-benzoquinon cho một băng đặc trƣng với cƣờng độ mạnh trong vùng 215-300nm. Vì vậy, để xác định p-benzoquinon cũng nhƣ các dẫn xuất của p- benzoquinon bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thu cực đại trong vùng quang phổ tử ngoại 200-350nm
Chuẩn bị dung dịch Q-10 trong dung môi n-hexane: dung dịch Q-10 chuẩn và dung dịch Q-10 sau khi cô lập từ TLC. Lần lƣợt thiết lập phổ hấp thụ của các dung dịch Q-10 trên vùng quang phổ tử ngoại 200-380 nm bằng máy quang phổ. Trên phổ hấp thụ của từng dung dịch sẽ nhận thấy các cực đại hấp thu ứng với độ dài sóng mà ở đó sự hấp thu là cực đại, so sánh với cực đại hấp thu của dung dịch Q-10 chuẩn để kết luận.
2.3.5.3. Định lƣợng Q-10 bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thu tử ngoại
Từ định luật Lambert-Beer, ta có: A = .C.b (với A: độ hấp thu hay mật độ quang; C: nồng độ dung dịch chất thử (mol/lit); : độ hấp thu phân tử; b: độ dày của cốc đo). Khi độ dày của cốc đo không đổi, dựa vào mối liên quan giữa cƣờng độ hấp thu và nồng độ của dung dịch cần đo, có thể định lƣơng Q-10 bằng phƣơng pháp đƣờng cong chuẩn.
Pha dung dịch Q-10 chuẩn theo các giai nồng độ xác định, đo mật độ quang của các dung dịch này tại độ dài sóng hấp thu cực đại vừa xác định đƣợc (mục 2.5.2). Sau đó thiết lập đƣờng cong chuẩn nồng độ Q-10. Tiếp theo xác định mật độ quang của dung dịch cần định lƣợng, từ đồ thị suy ra nồng độ của dung dịch cần định lƣợng.
37