2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RAPD (Random
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.2.2.1 Phản ứng RAPD-PCR
Bảng 2.2: Các mồi ngẫu nhiên đã được chọn cho phản ứng RAPD-PCR
STT Tên mồi Trình tự Nhà cung cấp
1 OPA-7 5’-GAAACGGGTG-3’ Sigma-Aldrich
2 OPA-12 5’-TCGGCGATAG-3’ Sigma-Aldrich
3 OPC-6 5’-GAACGGACTC-3’ Sigma-Aldrich
4 OPN-9 5’-TGCCGGCTTG-3’ Sigma-Aldrich
5 OPP-4 5’-GTGTCTCAGG-3’ Sigma-Aldrich
6 OPX-4 5’-CCGCTACCGA-3’ Sigma-Aldrich
7 OPX-14 5’-ACAGGTGCTG-3’ Sigma-Aldrich
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RAPD-PCR
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối / phản ứng
PCR buffer của Biorad 10 X 1 X
MgCl2 của Biorad 50 mM 2.5 mM
dNTPs từ Sigma 10 mM 0.08 mM
Mồi từ Sigma-Aldrich 100 mM 0.4 mM
Taq polymerase của Promega 5U/ µl 1 U
DNA khuôn 25 ng
H2O khử ion tiệt trùng Vừa đủ 25 µl
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt trong phản ứng RAPD-PCR
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
1 94 0C 2 phút 1 94 0C 45 giây 36 0C 1 phút 2 72 0C 2 phút 45 3 72 0C 3 phút 1
Bảng 2.5: Điều kiện điện di sản phẩm RAPD-PCR trên gel polyacrylamide
Nồng độ gel Hiệu điện thế Thời gian Thuốc nhuộm
10% 90 voltage 130 phút Ethidium bromide
Kết quả điện di được hiển thị dưới đèn UV và được chụp lại qua hệ thống Dolphin Doc (Wealtec).
2.2.2.2 Phân tích kết quả đa hình từ RAPD-PCR
Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD – PCR với nguyên tắc “1” nghĩa là có sự xuất hiện vạch khuyếch đại, “0” là không có vạch khuyếch đại. Chỉ các băng rõ, ổn định, và lặp lại có kích thước 200-2000 bp được dùng trong phân tích dữ liệu. Các vạch mờ được loại bỏ.
Để hiển thị mối quan hệ di truyền giữa các mẫu khảo sát, 1 sơ đồ hình cây được xây dựng dựa trên chỉ số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1.
Ma trận nhị phân được sử dụng để tính các tham số di truyền bằng chương trình POPGENE version 1.31 [67]. Các tham số quan tâm là: Hệ số đa dạng di truyền của quần thể (Hs) và của toàn bộ mẫu khảo sát (Ht), mức độ biến động di truyền trong quần thể (Hs/Ht) và mức độ khác biệt nhau về di truyền giữa các quần thể (Gst) và hệ số dòng chảy gen (Nm). Tất cả các tham số đều được theo từng mồi và tính trung bình cho cả 8 mồi.
2.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp
RFLP-PCR vùng giữa hai gen trnL-trnF của DNA lục lạp
2.2.3.1 Phản ứng PCR khuyếch đại vùng trnL-trnF lục lạp
Bảng 2.6: Ba mồi đặc hiệu dùng khuyếch đại vùng trnL-trnF lục lạp.
STT Tên mồi Trình tự Nhà cung cấp
1 trn-c 5'- CGAAATCGGTAGACGCTACG -3' Sigma-Aldrich
2 trn-f 5'- ATTTGAACTGGTGACACGAG -3' Sigma-Aldrich
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR vùng trnL-trnF
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối / phản ứng
PCR buffer của Promega 5 X 1 X
MgCl2 của Promega 25 mM 2.5 mM
dNTPs từ Sigma 10 mM 0.08 mM
Mồi xuôi trnc 100 mM 15 mM
Mồi ngược trnf 100 mM 15 mM
Taq polymerase của Promega 5 U 1 U
DNA khuôn 10 ng 10 ng
H2O khử ion tiệt trùng Vừa đủ 50 µl
Bảng 2.8: Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR vùng trnL-trnF
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
1 94 0C 1 phút 1 94 0C 45 giây 55 0C 45 giây 2 72 0C 3 phút 35 3 72 0C 10 phút 1 4 4 0C Giữ
Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có nhuộm với ethidium bromide 1 mg/ml. Điện di được thực hiện trong 30 phút, ở 100 Voltage, trong dung dịch TAE 1 X, sử dụng thang chuẩn 100 bp của Promega. Kết quả điện di được quan sát bằng máy Dolphin Doc (Wealtec).
2.2.3.2 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
Nguyên vật liệu:
Bộ kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega) Tiến hành:
Đặt SV Minicolumn vào Collection Tube, thêm đồng thể tích Membrane Binding Solution vào eppendorf chứa sản phẩm PCR cần tinh chế, chuyển hỗn hợp vào SV Minicolumn, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần chảy qua màng, thêm 700 µl Membrane Wash Solution (đã bổ sung EtOH 95%), ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch chảy qua màng.
Lặp lại bước trên với 500 µl Membrane Wash Solution, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, ly tâm lại SV Minicolumn với Collection Tube trống trong 1 phút nhưng không đậy nắp nhựa trong máy ly tâm để bay hơi hết cồn.
Chuyển cột SV Minicolumn vào eppendorf 1.5 ml sạch, thêm 20 µl Nuclease Free Water vào SV Minicolumn, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, bảo quản DNA ở 4 0C hay -20 0C.
Hoặc có thể tinh chế bằng phương pháp sau:
50 µl sản phẩm PCR + 50 µl phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Hút lấy pha nước, bổ sung 5 µl NaOAc 3 M và 150 µl EtOH 99,7%. Ủ ở -20 0C trong 15phút. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ phần dịch nhẹ nhàng, để khô cắn đến khi cồn bay hơi hết. Hòa tan cắn trong lượng nước cất thích hợp.
2.2.3.3 Phảnứng cắt với enzyme cắt giới hạn – RFLP
Phản ứng cắt được thực hiện với hai enzyme cắt giới hạn là XbaI từ Promega và
Bảng 2.9: Enzyme cắt giới hạn được dùng trong phản ứng RFLP
STT Tên enzyme Trình tự nhận biết Nhà sản xuất
1 XbaI 5'…T▼CTAG A…3'
3'…A GATC▲T…5' Promega
2 ApoI 5'…R▼AATT Y …3'
3'…Y TTAA▲R…5' Biolabs
Trong đó: R: A hoặc G Y: C hoặc T
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng cắt với enzyme XbaI
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích / phản ứng Nồng độ cuối H2O khử ion tiệt trùng 34 µl 10 X buffer D 10 X 5 µl 1 X Acetylated BSA, 10 µg/µl 10 µg/µl 0.5 µl 0.1 µg/µl DNA khuôn 10 µl 1 µg/µl XbaI 12 U/µl 0.5 µl 6 U
Bảng 2.11: Thành phần phản ứng cắt với enzyme ApoI
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu
Thể tích /
phản ứng Nồng độ cuối
H2O khử ion tiệt trùng 34 µl
10 X NEBuffer3 10 X 5 µl 1 X
100 X BSA 10 µg/µl 0.5 µl 0.1 µg/µl
DNA khuôn 10 µl 1 µg/µl
- Sử dụng một eppendorf đã tiệt trùng làm vật chứa cho phản ứng cắt.
- Lần lượt cho các thành phần phản ứng vào eppendorf theo thứ tự sau: nước khử ion, buffer D (XbaI) hoặc NEBuffer3 (ApoI), BSA và DNA khuôn với thể tích như trong Bảng 2.10 và Bảng 2.11 và trộn đều hỗn hợp bằng pipette.
- Cho 0.5 µl enzyme cắt giới hạn vào hỗn hợp phản ứng và trộn đều hỗn hợp bằng pipette, sau đó spin nhẹ. (Bỏ qua bước này đối với chứng âm).
- Ủ ở 37 0C đối với XbaI hay 50 0C đối với ApoI trong 2 giờ.
- Phân tách sản phẩm cắt bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 10% có nhuộm với ethidium bromide 1mg/ml. Điện di được thực hiện trong 90 phút, ở 90 voltage, trong dung dịch TAE 1X, sử dụng thang chuẩn 100 pb của Promega.
- Hiển thị kết quả điện di bằng bộ thiết bị đọc gel Dolphin Doc (Wealtec).
2.2.3.4 Giải trình tự đoạn giữa hai gen trnL-trnF
Một số mẫu đại diện cho các quần thể khác nhau sẽ được chọn để gửi giải trình tự tại Công ty Nam Khoa (Quận 7, Tp.HCM, Việt Nam) và Macrogen (Hàn Quốc), sử dụng 3 mồi trn-c, trn-d, trn-f.
3. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
3.1 Đa dạng di truyền thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật
RAPD
3.1.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR 3.1.1.1 Sàng lọc mồi 3.1.1.1 Sàng lọc mồi
Sử dụng 9 mẫu ngẫu nhiên gồm BD1, BD2, BD3, TQ, XT, NV1, NV2, NV3, NV4 cho phản ứng RAPD-PCR với 27 mồi 10-mer oligonucleotide để sàng lọc các mồi hữu hiệu dùng cho nghiên cứu. Một số mồi có sẵn trong phòng thí nghiệm và số khác được tham khảo từ tác giả Collins [26]. Hầu hết 27 mồi đều cho kết quả đa hình trên 9 mẫu. Tuy nhiên, chỉ có 08 mồi: OPA-07, OPA-12, OPC-06, OPN-09, OPP-04, OPX-04, OPX-14, OPX-15 cho kết quả với các băng phân biệt rõ, riêng biệt, nên được chọn để sử dụng cho phản ứng RAPD-PCR trên toàn bộ 50 mẫu nghiên cứu.
3.1.1.2 Kết quả khuyếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên
Để phát hiện sự đa hình, 08 mồi sau sàng lọc đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 cây thông đỏ. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những mồi này được phân tách bằng điện di 130 phút, 90 voltage trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm ethidium bromide và hiển thị dưới đèn UV.
Kết quả tổng hợp trong Bảng 3.1 cho thấy tổng số băng khuyếch đại thu được sau phản ứng PCR là 66. Như vậy, trung bình mỗi mồi khuyếch đại được 8.25 băng. Số băng khuyếch đại được từ các mồi dao động trong khoảng 7-11 băng. Có 63 trong số 66 băng là đa hình, chiếm tỉ lệ 95.31%. Tỉ lệ băng đa hình dao động trong
Tuy tỉ lệ băng đa hình cao, nhưng không mồi nào có thể được sử dụng làm marker để nhận diện các mẫu khác nhau từ các quần thể khác nhau. Ngoại trừ mồi OPA-07 có ba băng chỉ xuất hiện duy nhất một lần, đó là băng 490 bp trên mẫu NV25 (số 39), băng 400 bp trên mẫu TQ (số 13) và băng 280 bp trên mẫu HT7 (số 07). Các băng này có thể sử dụng làm marker để phân biệt ba mẫu trên với các mẫu còn lại.
Bảng 3.1: Kết quả RAPD của 50 mẫu thông đỏ với tám mồi chọn lọc.
Tên mồi Trình tự Tổng Số băng Tỉ lệ băng đa
OPA-7 5’-GAAACGGGTG-3’ 10 10 100 OPA-12 5’-TCGGCGATAG-3’ 7 7 100 OPC-6 5’-GAACGGACTC-3’ 7 7 100 OPN-9 5’-TGCCGG CTTG-3’ 8 8 100 OPP-4 5’-GTGTCTCAGG-3’ 8 7 87.5 OPX-4 5’-CCGCTACCGA-3’ 11 11 100 OPX-14 5’-ACAGGTGCTG-3’ 7 7 100 OPX-15 5’-CAGACAAGCC-3’ 8 6 75 Tổng cộng 66 63 Trung bình 8.25 7.88 95.31
Hình 3.1: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA-07
Hình 3.3: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC-06
Hình 3.5: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPP-04
Hình 3.7: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-14
3.1.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) đơn giản (SM coefficient)
Tương quan di truyền giữa các mẫu được tính toán bằng phần mềm NTSYS-pc 2.1 dựa trên hệ số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient).
Kết quả Bảng B, phần phụ lục, cho thấy 50 mẫu khảo sát tạo thành 1225 cặp, với hệ số tương quan di truyền từng cặp nằm trong khoảng 44% – 92%. Trung vị (median) tính được là 70%. 615/1225 cặp có hệ số tương quan thấp hơn 70% và 610/1225 cặp có hệ số tương quan từ 70% trở lên. Hệ số tương quan di truyền xuất hiện với tần suất nhiều nhất (mode) là 68%, với 100/1225 cặp.
Cặp mẫu khác nhau nhiều nhất là HT7 & NV16 (44%) và cặp tương đồng nhiều nhất là NV21 và NV22 (92%). HT5 và NV16 là hai mẫu có hệ số tương quan di truyền thấp nhất (khoảng cách di truyền xa nhất) so với toàn bộ mẫu khảo sát. HT5 tạo ra các hệ số tương quan di truyền trong khoảng 45% - 68% với 49 mẫu còn lại. NV16 tạo ra các hệ số tương quan di truyền trong khoảng 44% - 70%.
Ba mẫu từ Bidoup tạo ra 3 hệ số tương quan di truyền 85%, 73% và 79% tương ứng giữa từng cặp BD1 & BD2, BD1 & BD3 và BD2 & BD3. Điều đó cho thấy có nhiều khác biệt giữa BD3 khi so với BD1&BD2.
08 mẫu từ Hồ Tiên tạo ra 28 hệ số tương quan di truyền trong khoảng 47% - 86%, xa nhau nhất là HT5 & HT7 (47%), gần nhất là hai mẫu HT3 & HT4 (86%). HT5 là mẫu có tương quan di truyền thấp nhất với các mẫu còn lại, với hệ số tương quan di truyền trung bình chỉ ở mức 56%.
36 mẫu từ Núi Voi có hệ số tương quan di truyền trong khoảng 50% - 92%, xa nhau nhất (50%) là hai cặp mẫu NV2 & NV16, NV14 & NV16, và gần nhau nhất là cặp mẫu NV21 & NV22 (92%).
Mẫu TQ được xem là T. chinensis có hệ số tương quan di truyền với các mẫu còn lại từ Lâm Đồng ở mức trung bình, trong khoảng 52% - 67%.
Kết quả phân tích của NTSYS bên trên cho thấy hầu hết các mẫu khảo sát khá gần nhau về khoảng cách di truyền. Điều này cũng hoàn toàn hợp lý vì đa số các mẫu đều được thu thập từ các vùng rừng núi của Lâm Đồng – nơi mà theo ghi nhận của các nhà Lâm học nước ta là chỉ có sự tồn tại của một loài thông đỏ, thông đỏ nam –
Taxus wallichiana Zucc. Thêm vào đó, thông đỏ là cây gỗ lâu năm, thụ phấn nhờ
gió, hạt được phát tán nhờ động vật, nên về lý thuyết chúng sẽ không có tính đa dạng cao về mặt di truyền.
Tính đa dạng di truyền thấp cũng được các nhà khoa học trên thế giới công bố đối với các quần thể Taxus khác như T. wallichiana vùng Đông Bắc Ấn Độ [56],
T. wallichiana khu vực phía tây Himalaya [45], T. fuana vùng Pakistan [58], khi sử
dụng các marker phân tử RAPDs và AFLP.
3.1.3 Phân nhóm di truyền các mẫu thông đỏ khảo sát
Ma trận hệ số tương quan di truyền được dùng làm dữ liệu đầu vào để xếp nhóm cho 50 mẫu khảo sát, sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1, theo phương pháp SAHN. Kết quả thu được ở Bảng 3.2 và Hình 3.9 cho thấy nếu xét ở mức độ 60% tương quan di truyền thì toàn bộ mẫu khảo sát tạo ra một nhóm lớn với 47 mẫu, một nhóm nhỏ với hai mẫu TQ & NV16 và 1 mẫu đơn lẻ là HT5.
Xét ở mức độ 68% tương quan di truyền thì 47 mẫu trong cùng một nhóm ở trên sẽ phân thành 2 nhóm A và B:
Nhóm A gồm 5 mẫu: HT6, NT, NV9, NV5, NV18
Nhóm B gồm toàn bộ 42 mẫu còn lại. Tuy nhiên, ở mức 69% tương quan di truyền thì nhóm B lại được phân thành hai nhóm nhỏ B1 và B2:
o B1 là nhóm của 6 mẫu HT còn lại của quần thể Hồ Tiên.
o B2 gồm 36 mẫu còn lại và tiếp tục phân nhánh thành 2 tiểu nhóm nhỏ ở mức 69.5%. Tiểu nhóm B2a chỉ chứa 2 mẫu NV14 và NV15. Tiểu nhóm B2b bao gồm 34 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm nhỏ B2b1 và B2b2 khi xét ở mức khoảng 70.5% tương quan di truyền.
Bảng 3.2: Sự phân nhóm di truyền của 50 mẫu khảo sát. Phân nhóm Nhóm Nhóm nhỏ Tiểu nhóm Tiểu nhóm nhỏ Mẫu I HT5 II TQ, NV16 A HT6, NT, NV9, NV5, NV18 B1 HT1, HT2, HT8, HT3, HT4, HT7 B2a NV14, NV15 B2b1 NV6, NV8, NV7, NV11, NV10, NV12, NV13 III B B2 B2b B2b2 BD1, BD2, XT, BD3, NV1, NV2, NV34, NV4, NV27, NV35, NV32, NV33, NV19, NV21, NV22, NV20, NV23, NV24, NV26, NV25, NV29, NV17, NV36, NV3, NV30, NV28, NV31
Tuy các mẫu khảo sát có tương quan di truyền cao, nhưng vẫn có sự phân nhóm giữa các mẫu được thu thập giữa các vùng khác nhau. Cụ thể là đa số các mẫu từ Hồ Tiên đều thuộc cùng 1 nhóm trong khi đa số các mẫu thu thập từ Núi Voi cũng tập hợp thành một nhóm khác. Kết quả này thể hiện khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong cùng một vùng nhỏ hơn khoảng cách di truyền giữa các vùng địa lý với nhau. Kết quả này cho thấy có sự tương quan giữa khoảng cách địa lý và khoảng cách di truyền giữa các cá thể thông đỏ Lâm Đồng.
Kết quả & Bàn luận Coefficient 0.56 0.60 0.64 0.68 0.72 0.76 0.80 0.84 0.88 0.92 HT1 HT2 HT8 HT3 HT4 HT7 BD1 BD2