Hàm lượng Cl = *BSL
2.2.12 Phương pháp kiểm tra tổng khuẩn.
Dụng cụ: - Máy đo pH. - Ống đong 100ml, 250ml vô trùng. - Nồi hấp tiệt trùng. - Tủ cấy. - Cân kỹ thuật.
- NaOH 1M: cân 4g NaOH cho nước cất hòa tan và định mức đến 100ml.
- HCl 1M: cho 8.5ml HCl 37% vào bình định mức chứa sẵn một ít nước cất và định mức lên 100ml.
- Môi trường Plate count agar (PCA): cân 22.5g môi trường PCA cho vào 1000ml nước cất chỉnh pH bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M, gia nhiệt để hòa tan, phân phối vào bình và tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng 121°C trong thời gian 15 phút, pH sau tiệt trùng đạt 7.2±0.2.
- Đệm photphat: cân 34g KH2PO4 hòa tan trong 500ml nước cất chỉnh pH về 7.2 bằng NaOH 1M. Định mức đến 1000ml bằng nước cất. Tiệt trùng ở 121°C trong thời gian 15 phút, bảo quản trong tủ lạnh.
- Nước pha loãng: lấy 2.5ml dung dịch đệm photphat, định mức 2000ml bằng nước cất. Cho vào mỗi bình 90ml, 1000ml, tiệt trùng ở 121°C trong thời gian 15 phút.
Các bước kiểm nghiệm - Chuẩn bị mẫu:
+ Cân 25g mẫu vào bình thủy tinh vô trùng, thêm 225ml nước pha loãng sau đó đồng nhất mẫu trong khoảng 2 phút, được nồng độ pha loãng 10-1.
+ Dùng pipet vô trùng lấy 10ml dung dịch nồng độ 10-1 cho vào bình có sẵn 90ml nước pha loãng (tránh bọt khí). Lắc hỗn hợp 25 lần theo hình vòng cung 30cm trong vòng 7 giây, được nồng độ 10-2.
+ Tiếp tục pha loãng mẫu tương tự như trên đến nồng độ thích hợp sao cho số khuẩn lạc trong đĩa từ 25-250 cfu.
- Nuôi cấy:
+ Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng nồng độ thích hợp vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.
+ Rót 12-15ml môi trường PCA (làm nguội 45°C±1°C) vào mỗi đĩa có mẫu.
+ Trộn đều mẫu và môi trường bằng cách xoay vòng và chuyển động tới lui đĩa petri trên bề mặt phẳng, để cho môi trường đông lại, ghi thông tin mẫu lên đĩa, lật ngược đĩa, đem nuôi trong tủ ấm ở 35°C trong 48±2 giờ.
Chú ý:
• Thời gian từ lúc pha loãng nồng độ đầu đến lúc rót môi trường đĩa mẫu cuối cùng không được quá 15 phút.
• Lắc lại bình mẫu đã pha loãng 25 lần theo hình vòng cung 30cm trong vòng 7 giây nếu để mẫu quá 3 phút trước khi cấy vào đĩa petri.
• Môi trường trước khi sử dụng phải được ổn định nhiệt độ trong bể điều nhiệt ở 45°C±1°C.
• Không được chồng đĩa lên nhau khi rót agar và khi agar đông đặc. - Tính kết quả và báo cáo kết quả:
+ Báo cáo chỉ với 2 con số có ý nghĩa đầu tiên. Chỉ làm tròn đến 2 chữ số có nghĩa khi chuyển sang tồng số sinh khuẩn. Làm tròn con số thứ 2 lên số cao nhất kế tiếp khi số thứ 3 là các số 6,7,8,9 và sử dụng 0 cho mỗi số liên tiếp ở bên phải từ số thứ 2. Làm tròn xuống khi số thứ 3 là các số 1,2,3,4. Khi số thứ 3 là số 5, làm tròn lên khi số thứ 2 là số lẻ và làm tròn xuống khi số thứ 2 là chẵn.
+ Số khuẩn lạc trên 1 đĩa khoảng 25-250, đếm số khuẩn lạc trên đĩa trong vùng được chọn kể cả các khuẩn lạc nhỏ (chấm nhỏ).
N= N: số khuẩn lạc trên ml(g) sản phẩm.
: tổng khuẩn lạc trên các đĩa được đếm. : số đĩa ở nồng độ đầu được đếm.
: số đĩa ở nồng độ thứ 2 đếm được. d: hệ số loãng ở nồng độ đầu đếm.
+ Nếu trong 2 đĩa có 1 đĩa có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng 25-250 thì chỉ sử dụng đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250.
+ Tất cả các đĩa đếm được ở 2 nồng độ có số khuẩn lạc ít hơn 25cfu: ghi lại số khuẩn lạc thực tế đếm được nhưng báo cáo kết quả tổng khuẩn ghi là <25/d.
+ Tất cả các đĩa ở 2 nồng độ nhiều hơn 250cfu nhưng ít hơn 100cfu/cm2. Chọn đĩa có số khuẩn lạc ước tính gần nhất với 250cfu/đĩa, đếm và nhân với hệ số loãng.
+ Tất cả các đĩa ở các nồng độ đều không có khuẩn lạc. Báo cáo kết tổng khuẩn <1/d (hệ số loãng thấp nhất).
+ Tất cả các đĩa có số khuẩn lạc trung bình lớn hơn 100cfu/cm2. Khi đó báo cáo kết quả tổng khuẩn là >100*d (hệ số loãng lớn nhất)* diện tích đĩa.