Dung dịch bảo quản mẫu:
Dung dịch tách chiết ARN: Trizol, cloroform, propanon, Ethanol 75%
Sinh phẩm cho phản ứng RT-PCR: Primer, Taq polymerase, 2XMix, nớc vô trùng không có men aza.
Hóa chất dùng cho chạy điện di: Dung dịch Agarose 1.5%, Ethidiumbromide, TBE 1X, loading bufer, Marker
Cặp mồi sử dụng trong đề tài này:
3.4. Ph-
ơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Phơng pháp phân lô gia cầm trong thí nghiệm
- Đối với gà: mỗi trại chia làm 2 lô, một lô thí
nghiệm (khoảng 2000 con) và một lô đối chứng (khoảng 200 con)
STT Primer Sequence Nhiệt
độ (0C ) Kích thớc (bp) 1 H5- 219F GAGTGAAGCGTCTC ATTTTG 50 378 H5- 515R GATCTTCTTGGTTG GTATTATTGTAGCTC C 50 378 2 H5- 515F CATACCCAACAATA AAGAGG 45 708 H5- 1220R GTGTTCATTTTGTTA ATGAT 45 708
- Đối với vịt: mỗi trại chia làm 2 lô: một lô thí nghiệm (tiêm vacxin khoảng 500 con), lô đối chứng (không tiêm vacxin khảng 50 con).
3.4.2. Phơng pháp lấy mẫu
Để tiến hành các chẩn đoán phòng thí nghiệm, việc lấy mẫu và vận chuyển mẫu đúng quy cách đóng vai trò đặc biệt quan trọng, quyết định kết qủa xét nghiệm.
Việc lấy mẫu phải đợc tiến hành đúng lúc, đúng vị trí, đúng kỹ thuật. Các mẫu dùng để phân lập virus tốt nhất đợc lấy trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm có biểu hiện triệu chứng bệnh cúm.
Với gà và vịt sống: mẫu bệnh phẩm đợc lấy là: dịch ngoáy mũi, dịch ngoáy họng, dịch ngoáy khí quản, dịch ngoáy ổ nhớp, mẫu phân, máu.
Đối với gà và vịt đã chết: bệnh phẩm lấy là: khí quản. Ruột, não, dịch khí quản, phổi. Có thể lấy bệnh phẩm ở các phủ tạng khác: lách, thận, tuyến tuỵ...
Bệnh phẩm cả con: Gia cầm đã chết đựng vào túi nilon, kèm theo nhãn ghi chủ gia cầm, dùng chỉ buộc kín, để vào trong hộp xốp, chèn đá lạnh xung quanh (tuỳ theo gia cầm to hay nhỏ, số lợng nhiều hay ít mà dùng loại hộp thích hợp); đậy nắp, gắn nhãn ghi ngời gửi, loại gia cầm, địa chỉ, dán băng dính cho kín; phun sát trùng bên ngoài, gửi đến nơi có điều kiện chẩn đoán xét nghiệm.
Cách lấy mẫu bệnh phẩm là dịch ổ nhớp (swab): Dùng tăm bông ngoáy lấy dịch ở hậu môn gia cầm, cho vào ống có dung dịch bảo quản, đậy kín, bảo quản lạnh, vận chuyển về nơi có điều kiện chẩn đoán xét nghiệm.
Cách lấy huyết thanh: huyết thanh đợc chắt ra từ máu.
Cách lấy máu: Thờng lấy máu ở tĩnh mạch cánh hoặc đâm thẳng vào tim. Lấy máu tĩnh mạch cánh: thờng là phơng pháp tốt và đơn giản nhất đối với gà, gà tây và với hầu hết các loại gia cầm khác nuôi trong điều kiện tự nhiên. Bộc lộ tĩnh mạch cánh bằng cách nhổ một số lông trên bè mặt tĩnh mạch vùng cánh, tĩnh mạch nằm dới vết lõm của cánh giữa khớp nối với cơ cánh tay. Nếu dùng cồn 700 hoặc chất sát trùng không màu thấm ớt vùng tĩnh mạch sẽ thấy tĩnh mạch rõ hơn. Ngời lấy máu dùng một tay giữ hai cánh áp vào nhau, cầm chặt hai cánh ở vùng phía trên và chọc kim vào tĩnh mạch cánh, kim đặt đối diện trực tiếp với máu tĩnh mạch chảy về tim.
Lấy máu tim: Gia cầm đợc đặt nằm ngửa, nhổ lông vùng hõm ngực, sát trùng để khô, đâm kim từ hõm ức song song với cột sống, hơi chếch về phía trái cho đến khi kim chọc vào tim. Máu sẽ chảy vào bơm tiêm, dùng tay kéo bơm
tiêm từ từ để hút máu. Kích thớc và chiều dài kim phụ thuộc vào kích thớc của gia cầm.
Máu lấy khoảng 2 – 3 ml là đủ. Nếu để máu đông chắt huyết thanh trong bơm tiêm thì phải kéo bơm tiêm dài ra, nút đầu kim tránh nguy hiểm, để bơm tiêm nằm ngang cho máu đông và chắt huyết thanh. Trờng hợp cho máu vào ống nghiệm thao tác phải nhanh chóng tránh đông máu trong bơm tiêm. Máu đợc để trong phòng nhiệt độ môi trờng tránh nơi quá nóng và ánh mặt trời chiếu trực tiếp, nếu có điều kiện tốt nhất là để vào tủ ấm 370C trong 30 phút, sau đó đặt ngăn lạnh 40C.
3.4.3. Các phơng pháp dùng trong phòng thí nghiệm
3.4.3.1. Phản ứng ức chế ngng kết hồng cầu (HI - Hemagglutination inhibition test)
Dung dịch và dụng cụ:
- Dung dịch chống đông (citrat natri 1%)
Citrat natri 1g
Nớc cất 100ml
- Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: NaCl 0.85%
NaCl 8.5 g
Nớc cất vừa đủ 1000ml
Tiến hành phản ứng:
- Chuẩn bị hồng cầu gà:
+ Lấy máu:1ml citrat natri1% +5ml máu gà + Rửa hồng cầu:
1 thể tích máu + 3 thể tích nớc sinh lý(0.85%). Ly tâm 1500- 2000/10phút, loại bỏ nớc nổi.
Làm tan cặn với 3 thể tích nớc sinh lý (so với thể tích máu ban đầu). Ly tâm 1500-2000v/p/5phút, loại bỏ nớc nổi.
Rửa thêm 1 lần nữa nh trên.
- Xử lý huyết thanh: 560C/30phút trong nồi đun cách thuỷ
- Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên: (HA)
Kháng nguyên để tan ở nhiệt độ phòng
Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngng kết hồng cầu vi l- ợng (HA)
Cho 50àl NaCl 0.85% vào một hàng 12 giếng.
Cho 50àl kháng nguyên vào giếng 1, dùng pipet trộn đều hút 50àl sang giếng thứ 2, trộn đều, làm tơng tự đến giếng thứ 11. Ta có kháng nguyên pha loãng bậc2. Giếng thứ 12 dùng làm đối chứng hồng cầu
Cho vào tất cả các giếng 50àl hồng cầu gà 0.5%, lắc nhẹ đĩa, để nhiệt độ phòng trong 30 phút, đọc kết quả.
Hiệu giá kháng nguyên tính đến độ pha loãng cuối cùng còn khả năng làm ngng kết hồng cầu gọi là 1 đơn vị HA
Trong phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu dùng kháng nguyên 8 đơn vị (8 đơn vị HA) pha trong dung dịch pha loãng kháng nguyên
- Cách tính 8 đơn vị HA:
+ VD: 1 đơn vị HA là 1/256 thì 8 đơn vị HA là 8*1/256= 1/32 + Nghĩa là pha 1ml virus ban đầu + 31ml NaCl 0.85%
+ Chuẩn lại 8 đơn vị HA bằng phản ứng HA.
Cách đánh giá 8 đơn vị HA: Virus ngng kết ở 3 giếng đầu tiên là đạt tiêu chuẩn
- Tiến hành phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu vi lợng (HI)
Cho 25àl NaCl 0.85% từ giếng A đến giếng G Cho 50àl NaCl 0.85% vào các giếng ở hàng H
Cho 25àl huyết thanh đã xử lý vào giếng A. Dùng pipet trộn đều và hút 25àl từ giếng A đến giếng G (giữ lại 25àl ở hàng G) ta có huyết thanh pha loãng bậc 2. Hàng G dùng làm đối chứng huyết thanh.
Cho 25àl kháng nguyên 8 đơn vị HA vào các giếng trừ các giếng ở hàng G và H, lắc để nhiệt độ phòng 30 phút
Cho 50àl hồng cầu 0,5%, lắc đều để nhiệt độ phòng 30 phút Đọc kết quả.
o Chú ý: phải kiểm tra lại kháng nguyên 8 ĐV và các huyết thanh đối chứng mẫu (hàng G), đối chứng hồng cầu (hàng H) cùng với phản ứng chính.
o Nhận định kết quả:
Huyết thanh có kháng thể kháng virus cúm khi có hiện tợng ngăn trở ng- ng kết hồng cầu ( hồng cầu tụ lại dới đáy giếng).
Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh còn có khả năng ngăn trở ngng kết hồng cầu hoàn toàn.
3.4.3.2. Phân lập virus cúm gia cầm
Mẫu bệnh phẩm và mẫu ngoáy dịch ổ nhớp đợc giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập virut trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu. Nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì phải giữ ở nhiệt độ -700C.
Môi trờng bảo quản mẫu Glycerol medium đợc pha chế theo công thức: 1.PBS NaCL 8 g KCL 0.2 g Na2HPO4 1.15 g KH2PO4 0.2 g Nớc vừa đủ 1 lít
2. Trộn PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1 để đợc 1 lít dung dịch 3. Trong 1 lít PBS/Glycerol cho
Penicillin G 2*106 UI Streptomycin 200 mg Polymycin B 2*106 UI Gentamicin 250 mg Nystatin 0.5*106 UI Ofloxacin 60 mg Sunfamethazde 0.2 g
a. Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction).
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đợc Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985. Đây là phơng pháp tạo dòng invitro cho phép khuếch đại một vùng ADN (Deoxyribonucleic) đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và khổng lồ mà không cần đến việc tách và nhân dòng. Có thể sử dụng phản ứng PCR để làm tăng số lợng các mảnh gen của virus cúm có trong mẫu cần chẩn đoán, sau đó so sánh trình tự ADN đó với trình tự ADN khác của virus cúm đã đợc đăng ký trong ngân hàng dữ liệu gen.
Nguyên lý của phản ứng PCR dựa vào đặc điểm sao chép ADN, ADN polymerase sử dụng các đoạn ADN mạch đơn để tổng hợp nên sợi bổ sung mới.
Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động để tổng hợp nên sợi ADN mới từ mạch khuôn thì đều cần có sự hiện diện cuả những cặp mồi (Primer) đặc hiệu để khởi đầu cho quá trình tổng hợp.
Mồi là những đoạn ADN ngắn (thờng có độ dài từ 6-30 nucleotit) có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của ADN sợi khuôn, 1ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo thành ADN mới.
Tuy nhiên, để khuếch đại một trình tự ADN xác định thì ta phải có đợc thông tin về trình tự gen của nó đủ để tạo mồi chuyên biệt. Một cặp mồi gồm có mồi xuôi (sens primer) và mồi ngợc (antisens primer). Trong phản ứng PCR thì cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu nh mồi đợc cung cấp cho cả hai sợi. Các đoạn mồi sẽ bắt cặp với hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên sao cho sự tổng hợp ADN mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi bổ trợ với nó. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ của phản ứng thì số đoạn sao ADN cần nhân lên đợc tăng lên gấp đôi và điểm khởi đầu cho mồi bắt cặp lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới đợc tổng hợp. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR sau n chu kỳ đợc tính theo lý thuyết là 2n bản sao của phân tử ADN mạch kép.
Nh trên đã trình bầy, phản ứng PCR chỉ có khả năng khuếch đại ADN do đó với những trờng hợp mà thông tin di truyền là ARN nh virus cúm thì cần có một quá trình chuyển từ ARN thành ADN trớc khi diễn ra phản ứng PCR. Đó là phản ứng sao chép ngợc RT-PCR (Reverse Transcription Polymerae Chain Reaction).
Mẫu bệnh phẩm là: dịch, ổ nhớp, phân, hoặc mẫu bệnh phẩm phân lập từ trứng hoặc môi trờng tế bào. Kỹ thuật này gồm các bớc sau đây:
- Tách chiết ARN bằng Trizol
Quá trình tách chiết ARN từ các mẫu đợc tiến hành trong phòng thí nghiệm kín có gắn máy lọc Hepa-Filter, theo quy trình sau:
Đối với mẫu bệnh phẩm dùng cối chày sứ nghiền nát bệnh phẩm ra rồi bổ sung 1-1.5 ml dung dịch Transport medium
Đối với mẫu dịch ngoáy ổ nhớp thì đảo đều bằng máy vortex rồi vắt bỏ các tăm bông ra
Sau đó ly tâm khoảng 3000 vòng/ phút trong 10 phút lấy nớc trong (mẫu). Cho 100àl mẫu vào tuýp 1.5ml
Cho thêm 1000à l Trizol vào
Đảo đều trong vài giây. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Cho thêm 200àl Chloroform. Đảo kỹ trong 15 giây. Để ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
Lấy khoảng 400àl phần nớc nổi (nớc màu trắng) sang tuýp 1.5 mới. Chú ý: không đợc để lẫn với phần nớc màu đỏ. Nếu bị lẫn với phần nớc màu đỏ thì phải ly tâm lại.
Cho thêm vào 500àl isopropanol. Đảo nhẹ 3 - 4 lần. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút.
Đổ bỏ phần nớc nổi. Chú ý phần ARN lắng xuống dới (có thể không nhìn thấy) nên khi đổ phải từ từ, cẩn thận tránh đổ ra ngoài.
Cho 1000àl Ethanol 75% vào. Đảo thật kỹ để rữa sạch ARN. Ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút.
Đổ bỏ phần nớc nổi. Chú ý: phần ARN lắng xuống dới (có thể không nhìn thấy) nên khi đổ phải từ từ, cẩn thận để tránh phần cặn ra ngoài.
Để ở nhiệt độ phòng để ethanol bay hơi hết (khoảng 10 phút). Tránh để ARN bị khô.
Cho 20-50àl nớc không có men ARNase vào. Trộn đều để làm tan ARN. Bảo quản ở tủ –800C.
- Tiến hành phản ứng RT-PCR phát hiện ARN của virus (SuperScript One- Step RT-PCR with Platinum Tag Hãng Invitrogen; Cat no: 10928-042)
Chuẩn bị: Mẫu ARN Primers
Nớc không có men ARNase và ADNase pipepman 10,20,100,200, 1000àl
Đầu tuýp 10,20,100,200,1000àl
Tiến hành: -Pha master mix theo thứ tự sau (cho một phản ứng)
stt Thành phần Phản ứng
10àl 20àl 50àl
1 Nớc 1,8 2,6 9,0
2 RT/Plat Tag Mix 0,2 0,4 1,0
3 Primer 1,0 2,0 5,0
4 2X Reaction Mix 5,0 10,0 25,0
5 ARN 2,0 4,0 10,0
Tổng 10 20 50
- Bớc 1: 500C 30 phút - Bớc 2: 940C 02 phút - Bớc 3: 940C 30 giây - Bớc 4: XX0C 40 giây 40 vòng - Bớc 5: 720C 40 giây - Bớc 6: 720C 10 phút - Bớc 740C ∞
XX0C là nhiệt độ tơng ứng với bảng trên mục 3.2.3. - Đọc kết quả sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm RT-PCR đợc kiểm tra trên gel Agarose 1.5% Đổ gel Agarose:
Chuẩn bị khuôn và lợc để đổ gel
pha gel agarose 1.5% trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE Đun cách thuỷ ( hoặc dùng lò vi sóng) để gel tan hoàn toàn
Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C cho Ethidium bromide 1/10000. Lắc đều. Chú ý: Ethidium bromide rất độc nên phải rất cẩn thận không đợc dây vào da.
Đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lợc đợi khi gel nguội thì tháo bỏ lợc
Chuyển gel vào máy chạy điện di đã có dung dịch đệm TAE hoặc TBE: chú ý để gel với đầu có giếng vào phía cực (-)
Chạy điện di:
Dùng pipette lấy khoảng 10àl sản phẩm PCR trộn đều với 1àl loading buffer trên giấy parafim rồi cho vào giếng trên gel.
Chạy điện di theo chiều từ (-) sang (+), 100mV trong khoảng 30 phút Đọc kết quả bằng máy đọc gel (UV-transillimminator).
b. Phân lập virus trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi
Virut cúm gà phát triển tốt trong xoang niệu nang của phôi trứng gà ấp 9-11 ngày tuổi. Tiêm 0,1 - 0,3ml huyễn dịch bệnh phẩm (ruột, não, khí quản...) vào xoang niệu mô của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín và tiếp tục cho ấp ở nhiệt độ 370C trong 2 - 3 ngày. Một số ít chủng virus có độc lực cao có thể gây chết phôi khoảng 18-24 giờ, nớc trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm, virus nhân lên trong nớc trứng có hiện tợng ngng kết hồng cầu gà. Nếu không ngây ngng kết thì cần lấy nớc trứng thu đợc tiêm lần sau cho phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi. Sau đó tiến hành phản ứng HI nh trên.
Thời kỳ ủ bệnh rất ngắn từ vài giờ đến 3 ngày tuỳ theo lợng virut, đờng nhiễm bệnh và loài cảm nhiễm virut gây bệnh.
+ Thể quá cấp tính (hay gặp) xảy ra từ vài giờ đến 24h +Thể cấp tính từ 1 – 4 ngày.
Biểu hiện triệu chứng lâm sàng phụ thuộc rất nhiều yếu tố nh: Chủng virut, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính, liều gây nhiễm, môi trờng (độ bụi, thừa Amoniac...), chế độ dinh dỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trớc khi nhiễm virut và sự cộng nhiễm cùng với virut cúm gia cầm của các vi khuẩn, virut khác nh Ecoli, Mycoplasma, Newcastle ...
Nhiều trờng hợp gà bị dịch cúm nhng không có dấu hiệu lâm sàng, song cũng có nhiều trờng hợp dịch nổ ra dữ dội với các triệu chứng điển hình về đờng hô hấp, tiêu hoá và thần kinh.
Các triệu chứng hô hấp thờng xuyên sớm và khá điển hình nh khoẹc, lắc đầu, vẩy mỏ, chảy nớc mũi, nớc mắt, gà há mồm thở dốc. Gà chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cao tới 100% trong vài ngày.
Mí mắt bị viêm, sng, sng mọng. Mặt phù nề và đầu sng to.
Mào và tích bị dày lên do thuỷ thủng, có rất nhiều điểm xuất huyết, nhiều trờng hợp thấy hoại tử .
Thịt gà bệnh bị thâm xám, xuất huyết dới da vùng chân là những biểu hiện đặc trng của bệnh cúm gà.
Các biểu hiện thần kinh: Gà đi lại không bình thờng, chệnh choạng, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì hoặc đứng tụm đống với nhau, lông xù. Gà giảm đẻ rõ rêt.
Gà bị tiêu chảy mạnh, rối loạn thần kinh, bệnh lây lan nhanh. Đó là những