chồi của các giống nghiên cứu
Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Cytokinin thường được dùng phổ biến trong nghiên cứu nuôi cấy mô
invitro là kinetin và 6-benzyl aminopurin (BAP). BAP là một loại cytokynin
tổng hợp nhân tạo và có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Sự có mặt của BAP trong môi trường giúp kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào [20]. Để nghiên cứu ảnh
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành lựa chọn những mô sẹo tốt nuôi cấy trên 4 loại môi trường có hàm lượng BAP tăng dần như sau:
(R1): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 1 mg/l BAP (R2): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 2 mg/l BAP (R3): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 3 mg/l BAP (R4): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 4 mg/l BAP Sau khi chồi được hình thành, chúng tôi tiến hành tách chồi và nuôi cấy vào 4 loại môi trường trên để đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi của cỏc dũng nghiên cứu. Kết quả cụ thể được tổng hợp qua bảng 3.3:
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân chồi từ mô sẹo của cỏc dũng lỳa nghiên cứu
Môi
trường Dòng
Khả năng tái sinh chồi Khả năng nhân chồi
Tổng số
mẫu chồi tái sinh Số mẫu có Tỷ lệ tái sinh chồi (%) chồi cấy vào Tổng số Tổng số chồi tạo thành Hệ số nhân chồi
R1 N18 45 10 22,22 70 182 2,60 N46 30 15 30,0 50 165 3,30 N91 45 17 37,78 80 190 2,37 NV1 45 13 28,89 70 145 2,07 Chung 165 55 33,33 270 682 2,52 R2 N18 45 14 31,11 70 250 3,57 N46 30 20 66,67 50 395 7,90 N91 45 26 57,78 80 470 5,87 NV1 45 15 33,33 70 237 3,38 Chung 165 75 45,45 270 1352 5,01 R3 N18 45 18 40,0 70 415 5,93 N46 30 16 53,33 50 205 4,10 N91 45 18 40,0 80 210 2,62 NV1 45 21 46,67 70 380 5,43 Chung 165 73 44,24 270 1210 4,48 R4 N18 45 13 28,89 70 194 2,77 N46 30 10 33,33 50 158 3,16 N91 45 12 26,67 80 210 2,62 NV1 45 16 35,55 70 227 3,24 Chung 165 51 30,91 270 789 2,92
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương 0 10 20 30 40 50 60 70 80 R1 R2 R3 R4 Môi trường Tỷ l ệ tá i si nh ( % ) N18 N46 N91 NV1
Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R1 R2 R3 R4 Môi trường H ệ số nh ân chồ i (l ần) N18 N46 N91 NV1
Biểu đồ 3.7: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi
Qua bảng số liệu trên, thấy rằng:
- Sự có mặt của BAP và α-NAA trong môi trường nuôi cấy là cần thiết cho sự tái sinh chồi cũng như quỏ trình nhõn chồi của cỏc dũng lúa nghiên cứu.
- Môi trường R1: Môi trường cơ bản có bổ sung 0,1 mg/l αNAA và 1 mg/l BAP, tỷ lệ tái sinh chồi chung cho cả 4 dòng là 33,33%, trong đó cao nhất ở
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
sinh chồi là 22,22%. Khi nuôi cấy chồi trên môi trường R1, thấy rằng hệ số tái sinh chồi cao nhất ở dòng N46 (3,30) và thấp nhất ở dòng NV1 (2,07), tính chung cho cả 4 giống hệ số nhân chồi khi sử dụng môi trường R1 là 2,52.
- Môi trường R2: Môi trường cơ bản có bổ sung 0,1 mg/l αNAA và 2 mg/l BAP, tỷ lệ tái sinh chồi của cỏc dũng đều tăng so với khi nuôi cấy trên môi trường R1. Dòng N46 tăng từ 30,0% lên 66,67%, dòng N91 tăng từ 37,78% lên 57,78%. Dòng N18 và NV1, tỷ lệ tái sinh chồi có tăng nhưng không đáng kể. Tính chung cho cả 4 dòng tỷ lệ này là 45,45%. Khi nuôi cấy chồi trên môi trường R2 cũng thấy rằng, hệ số nhân chồi của dòng N46 và N91 cao nhất so với khi nuôi cấy trờn cỏc loại môi trường khác, hệ số nhân chồi của dòng N46 là 7,90, của dòng N91 là 5,87. Trong khi đó hệ số nhân chồi của dòng N18 và NV1 lần lượt là 3,57 và 3,38. Tính chung cho cả 4 dòng hệ số nhân chồi là 5,01. Như vậy, môi trường R2 là môi trường phù hợp cho tái sinh chồi và nhân chồi của cỏc dũng N91 và N46.
- Môi trường R3: So với môi trường R2 nồng độ BAP được bổ sung cao hơn (3mg/l), thấy rằng: Đối với dòng N46 và N91 tỷ lệ tái sinh chồi giảm so với khi nuôi cấy trên môi trường R2. Ngược lại, dòng N18 và NV1 lại có tỷ lệ tái sinh chồi cao hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường R2, dòng N18 tăng từ 31,11% lên 40,0%, dòng NV1 tăng từ 33,33% lên 46,67%. Khi nuôi cấy chồi tái sinh trên môi trường R2 cũng thấy rằng, hệ số nhân chồi của hai dòng N46 và N91 giảm hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường R2. Hai dòng N18 và NV1 có hệ số nhân chồi tăng nhiều hơn, hệ số nhân chồi của dòng N18 tăng từ 3,57 lên 5,93, dòng NV1 tăng từ 3,38 lên 5,43. Như vậy, có thể thấy môi trường R3 là phù hợp để tái sinh chồi và nhân chồi đối với cỏc dũng N18 và NV1. Hiện tượng giảm tỷ lệ tái sinh chồi ở dòng N46 và N91 có thể là do nồng độ BAP tăng quá mức cực thuận cho việc tái sinh chồi của giống, dẫn đến ức chế sự hình thành chồi cũng như khả năng nhân chồi ở các dũng lúa này.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
- Môi trường R4: Khi tăng nồng độ BAP lên 4mg/l thấy rằng: Tỷ lệ tái sinh chồi cũng như hệ số nhân chồi đồng loạt giảm ở tất cả cỏc dũng lỳa. Tính chung cho cả 4 dòng, tỷ lệ tái sinh chồi từ 44,24% ở môi trường R3 giảm xuống còn 30,91% ở môi trường R4. Hệ số nhân chồi cũng giảm đáng kể từ 4,48 xuống còn 2,92 ở môi trường R4. Có thể hàm lượng chất kích thích sinh trưởng (BAP) tăng quá ngưỡng cực thuận đã có tác dụng làm ức chế sự tạo chồi cũng như nhân chồi của cỏc dũng nghiên cứu.
Nhận xét:
+ Môi trường R2 (MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 2 mg/l BAP) là môi trường tối ưu cho việc tái sinh chồi cũng như nhân chồi của cỏc dũng N46 và N91.
+ Môi trường R3 (MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 3 mg/l BAP) là môi trường tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi của cỏc dũng NV1 và N18.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.7: Chồi tái sinh sau 3 tuần nuôi cấy mô sẹo của 4 dòng lúa trên các môi trường tái sinh chồi khác nhau.
a) Dòng N18 trên môi trường R3
b) Dòng N46 trên môi trường R2
c) Dòng NV1 trên môi trường R2
d) Dòng N91 trên môi trường R3
- Trong số cỏc mụ sẹo được sử dụng để tái sinh chồi, chúng tôi nhận thấy có một số mô sẹo của dòng NV1 có hiện tượng bị bạch tạng một phần (Hình 3.8). Từ những mô sẹo này đã xuất hiện 4 cụm chồi bị bạch tạng, chiếm 7,02%
tổng số cụm chồi của dòng NV1 (Hình 3.9). Những chồi bạch tạng này bị chết khi được cấy chuyển sang môi trường nhân chồi.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
Hình 3.8: Mô sẹo xuất hiện bạch tạng ở dòng NV1
Hình 3.9: Cụm chồi bạch tạng ở dòng NV1
Nghiờn cứu về siêu cấu trúc tế bào lá cây bạch tạng cho thấy trong tiền lạp thể của cây bạch tạng không có ribosom. Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các protein hoặc các tiểu phần protein của lục lạp này không hoàn chỉnh, dẫn đến tình trạng vô sắc không phát triển thành lục lạp được. Cũng có giả thuyết giải thích hiện tượng bạch tạng là kết quả của hiệu ứng mẹ: hiệu ứng mẹ biểu hiện rõ ở một số đặc điểm di truyền tế bào chất; khi thụ phấn chỉ có nhân của tế bào sinh dục đực được chuyển sang tế bào noãn. Hạt phấn là tế bào chứa ít nguyên sinh chất, tức là số lượng ti thể và tiền lạp thể cũng là rất ít. Khi nuôi những tế bào này thành những cơ thể thực vật hoàn chỉnh có thể xảy ra hiện tượng mất cân đối tương tác di truyền giữa nhân và cơ quan tử, dẫn đến sai lệch trong quá trình phát sinh cơ quan tử đặc biệt là lục lạp [2].
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
DÒNG N46 DÒNG N18
DÒNG NV1 DÒNG N91
Hình 3.10: Chồi của các dòng lúa nghiên cứu sau 5 tuần nuôi cấy mô sẹo trên môi trường tái sinh chồi.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương