Trước khi tiến hành điện di phải đảm bảo nguyên tắc an toàn thực nghiệm như: Đeo găng tay cao su, khẩu trang chống độc, áo blue, … đặc biệt chú ý khi thao tác với dung dịch acrylamide ở trạng thái monomer.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
+ Chuẩn bị hóa chất:
Hóa chất dùng trong điện di enzyme được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.4: Các dung dịch gốc dùng cho điện di isozyme EST và POD
Stt Dung dịch Thành phần, nồng độ
1 Acrylamide + Bisacrylamide (A1) 30% T, 2,7% C 2 Acrylamide + Bisacrylamide (A2) 12,5% T, 20% C
3 Đệm gel tách (B1) 1,5 M Tris-HCl, pH = 8,8
4 Đệm gel cô (B2) 0,5 M Tris-HCl, pH = 6,8
5 Glycerol 60%
6 Amonium persulphate (APS) 10%
7 Đệm điện cực 0,025M Tris; 0,192M Glycine, pH = 8,3
8 Chỉ thị màu Bromophenol blue (BPB) 0,1%
9 Dung dịch đệm chiết mẫu 0,5M Tris; 60% Glycerol, 0,005M EDTA; 1% β-Mercaptoethanol; pH=6,8
10 Dung dịch nhuộm hoạt tính EST α-Naphthyl acetate; β- Naphthyl acetate; Fast Blue RR Salt; Aceton; đệm photphat (pH=6,3)
11 Dung dịch nhuộm hoạt tính POD Benzidin; H2O2 30%; Đệm acetate (pH = 5,6); Nước cất tinh khiết.
(Lưu ý: Dung dịch APS 10% và các dung dịch nhuộm hoạt tính isozyme chỉ được pha ngay khi sử dụng)
+ Đúc gel:
Quá trình điện di enzyme được tiến hành trên gel polyacrylamide với nồng độ gel tách là 6,0% hoặc 7,5% và nồng độ gel cô là 4,0%, đúc trong khuôn gel có kích thước 13 x 18 x 0,1 (cm).
Sau khi chuẩn bị đầy đủ các dung dịch cần thiết thì tiến hành đúc gel vào khuôn gel: Gel tách được đổ trước, cho đến khi gel tỏch đụng (sau khoảng 30 phỳt) thỡ tiến hành pha dung dịch gel cô rồi đổ gel cụ lờn phía trên gel tách và cài lược vào để tạo giếng nạp mẫu. Để gel tại nhiệt độ phòng trong
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương
2 giờ, sau đó bọc kín trong túi nilon và giữ gel trong tủ lạnh để dùng cho điện di vào sáng ngày hôm sau.
Bảng 2.5: Công thức gel dùng trong điện di isozyme (Nồng độ gen 7,5%)
Stt Hoá chất Gel tách 7,5% Gel cô 4,0 %
1 A1 4,5 ml 2 A2 1,92 ml 3 B1 4,5 ml 4 B2 1,5 ml 5 Glycerol 60% 4,5 ml 1,0 ml 6 Nước cất 2 lần 4,5 ml 1,5 ml 7 APS 10% 100 μl 60 μl 8 TEMED 12 μl 10 μl Tổng dung dịch 18 ml 6 ml
+ Chuẩn bị mẫu điện di
Lấy mẫu vào sáng sớm, khoảng 100mg mẫu lá được nghiền trong ống eppendorf với 400μl dung dịch đệm chiết mẫu. Nghiền mẫu phải được tiến hành trong điều kiện lạnh, có thể thêm một ít bông thủy tinh vào mẫu nghiền để rút ngắn thời gian nghiền mẫu. Dịch nghiền thô được ly tâm với tốc độ 6000 vũng/phỳt, trong 5 phút.
+ Tiến hành điện di
Để nạp mẫu cần nhẹ nhàng lược ra khỏi khuôn gel (phải đảm bảo các giếng đều nhau, không làm đứt thành giếng), mỗi một răng lược tạo nên một giếng chứa mẫu, thỏo giỏ kẹp và lắp gel vào máy điện di.
Đổ dung dịch đệm điện cực vào hai buồng điện di (tránh xuất hiện các bọt khí), sau đó dùng micropipete hút lấy 25 μl dịch chiết của mỗi mẫu và tra vào các giếng. Đổ đầy đệm điện cực và nhỏ thêm vài giọt chỉ thị màu BPB.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điện di isozyme được tiến hành trong điều kiện lạnh (4 – 80C) ở chế độ điện di như sau:
- Áp dụng cho điện di gel cô là: 100V, 24mA trong 45 phút đầu.
- Áp dụng cho điện di gel tách là: 150V, 24mA trong thời gian còn lại. Duy trì chế độ điện di đó cho tới khi vạch chỉ thị màu BPB cỏch đỏy gel 5mm thì ngừng điện di.
+ Nhuộm hoạt tính isozyme
a) Nhuộm hoạt tính EST:
α - naphthyl acetate………15mg β - naphthyl acetate………35mg (Hòa tan cơ chất trong 1ml acetone)
Fast Blue RR salt………40mg 0,1M Na-phosphate (pH = 6,3)………. 30ml
Khuấy cho tan hết Fast Blue RR salt trong dung dịch đệm, đổ dung môi đã hòa tan cơ chất, khuấy đều và đổ lên mặt gel đựng trong khay. Ủ gel ở nhiệt độ 400C trong 1h, cho đến khi các băng isozyme màu đỏ hoặc nâu hiện rõ. Sau đó rửa gel bằng nước cất và cố định gel trong dung dịch axit acetic 7%.
b) Nhuộm hoạt tính POD:
Benzidine………..35mg 1M Na – acetate, pH = 5,6………. 8ml 30% Hydrogene peroxide (H2O2)………. 20μl Nước cất hai lần………30ml
Ủ gel ở nhiệt độ 400C trong 1h, khi các băng hiện rõ, gel được lấy ra rửa bằng nước cất, cố định trong dung dịch axit acetic 7%. Tiến hành quan sát và chụp ảnh.
Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương